Dúvidas enviadas sábado, 5 de novembro de 2011, antevéspera da prova (se não for adiada) e durante o sagrado dia da vadiagem...
1. Durante a replicação de um trecho ocorre a formação de trechos estendidos e amplificados. O que isso implica para a PCR? Os trechos estendidos podem vir a alterar os resultados do PCR?
Resposta: Os fragmentos estendidos são gerados por cópia do DNA molde original. Assim, sua quantidade no tubo de reação cresce muito lentamente, quando comparada como a quantidade dos fragmentos amplificados. Rigorosamente, seu número aumenta em progressão linear, enquanto o número dos amplificados cresce em proporção exponencial. Por isso, ao final da reação, nem se percebe mais a presença dos fragmentos amplificados, que estarão numa proporção ínfima na mistura do produto final de reação. Logo, a conseqüência para o PCR é, rigorosamente, nenhuma.
2. Qual a diferença de controle negativo e positivo, exceto que o negativo usa água destilada ao invés de amostra. Funcionalmente em que eles diferem?
Resposta: A diferença entre os controles está corretamente descrita. Só que “amostra”, neste caso, significa um DNA que comprovadamente dará origem a um resultado positivo. Assim, no tubo controle negativo não haverá reação (em geral são muitos tubos) e no tubo controle positivo a reação deverá acontecer, gerando a banda desejada (ou as bandas, conforme o caso).
3. Como existe a garantia que na PCR todos os fragmentos terão o mesmo tamanho (número de pb), já que existem os trechos alongados?
Resposta: Esta pergunta está respondida anteriormente. Apenas para enfatizar, uma proporção ínfima dos produtos de reação será formado por um par de fitas desigual, sendo um deles a fita simples estendida e o outro a fita amplificada, um pouco menor de um dos lados do par.
4. Como se escolhe um primer para RAPD?
Resposta: Quando se começa um experimento, não há uma escolha propriamente dita, ensaiam-se dezenas de opções que vêm em kits com 10, 20 ou 50 primers diferentes; como não se sabe o que vai dar certo, usa-se a experiência de outros com este ou aquele conjunto de primers para o organismo que queremos ensaiar, mas sem nenhuma certeza. Depois que os resultados aparecem, aí sim, há uma escolha: o primer selecionado (se você tiver sorte, uns dois ou três) deve produzir um padrão complexo de bandas que pode distinguir os seus isolados em estudo uns dos outros de acordo com o fenótipo que lhe interessa (por exemplo, planta resistente a vírus).
5. O STR trata-se de uma região nos íntrons já que não se trata de um primer?
Resposta: STR é a sigla para small tandem repeats, isto é, pequenas repetições em tandem (ou uma atrás da outra). Em geral não oc0rrem em íntrons, mas nas regiões intergênicas. Tipicamente são formadas de di-nucleotídeos (p.ex., GCGCGC....) ou tri-nucleotídeos, mas podem ter outros temas.
6. O seqüenciamento de DNA é feito a partir de RAPD?
Resposta: Nunca! O seqüenciamento que hoje é clássico é feito a partir de um primer (só um) que se pareia com uma região do plasmídeo onde se inseriu a trecho de DNA que se deseja seqüenciar. EM cada ciclo milhões de sequências fita simples são estendidas, cada uma de uma cópia do plasmídeo que está no tubo de reação. Do PCR a técnica de seqüenciamento pegou emprestado a Taq polimerase, um primer, os dNTPs e o ciclo térmico, mas o que nos interessa como produto é a fita estendida, exatamente o que não interessa no PCR. O número de fitas estendidas é enorme porque a quantidade de DNA molde é sempre grande para o seqüenciamento, ao contrário do PCR. Por outro lado, nenhum produto de amplificação se forma, porque não se usa jamais dois primers e, portanto, não geramos produto amplificado algum (isso ocorre no RAPD por causa da baixa temperatura de pareamento, o que NÃO É o caso do sequencimamento).
Nenhum comentário:
Postar um comentário