Roteiro para ClustalW e Treeview

Roteiro para uso do ClustalW e visualização no Treeview

Exemplo com sequências de proteínas de primatas

Nosso objetivo é selecionar sequências de proteínas de primatas que são similares à HSP70 humana (presumivelmente têm a mesma função) e, empregando estas sequências, procurar avaliar se a árvore de distâncias genéticas entre as sequências agrupa de forma relevante (isto é, da forma como aceitamos pela taxonomia clássica) os primatas.

Para tal vamos começar com a sequência de HSP70 humana selecionada a partir de uma busca no banco de proteínas do NCBI com o string HSP70 Homo sapinens. O resultado traz muitas sequências, mas escolheremos a que está mostrada abaixo:

heat shock protein 70 [Homo sapiens]

701 aa protein

Accession: AAA02807.1 GI: 292160

O link para ela é: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAA02807.1

A partir da página da proteína clickamos à direita na opção RUN BLAST. Assim que a página do Blastp abrir, escolheremos para Organism a opção primates (inicie a digitação e aguarde para que a definição do táxon apareça) e, quando o serviço estiver concluído, escolheremos sequências de HSP70 de primatas que estejam aparentemente completas (com query coverage maior ou igual a 99%). Para isso basta clicar nos quadradinhos à esquerda de cada sequência escolhida, uma para cada primata, sem repetições. Uma vez feito isso podemos baixar todas as sequências no formato FASTA num arquivo único (clique em download, na linha acima da tabela e escolhafasta).  O arquivo vem no formato .txt e vai se chamar seqdump. Você vai encontrá-lo baixado em sues Downloads.

Você deve separar as sequências do arquivo com um espaço em branco entre elas. Para isso procure o sinal de > e manualmente separe as sequências. Também retire toda a informação depois do sinal de >, exceto no nome da espécie, que deve não ter espaços (sugerimos colocar um underline entre os dois nomes da espécie)

No final o aspecto ficará mais ou menos assim:

>Homo_sapiens

MSVVGIDLGFQSCYVAVARAGGIETIANEYSDRCTPACISFGPKNRSIGAAAKSQVISNAKNTVQGFKRFHGRAFSDPFV

EAEKSNLAYDIVQWPTGLTGIKVTYMEEERNFTTEQVTAMLLSKLKETAESVLKKPVVDCVVSVPCFYTDAERRSVMDAT

QIAGLNCLRLMNETTAVALAYGIYKQDLPRLEEKPRNVVFVDMGHSAYQVSVCAFNRGKLKVLATAFDTTLGGRKFDEVL

VNHFCEEFGKKYKLDIKSKIRALLRLSQECEKLKKLMSANASDLPLSIECFMNDVDVSGTMNRGKFLEMCNDLLARVEPP

LRSVLEQTKLKKEDIYAVEIVGGATRIPAVKEKISKFFGKELSTTLNADEAVTRGCALQCAILSPAFKVREFSITDVVPY

PISLRWNSPAEEGSSDCEVFSKNHAAPFSKVLTFYRKEPFTLEAYYSSPQDLPYPDPAIAQFSVQKVTPQSDGSSSKVKV

KVRVNVHGIFSVSSASLVEVHKSEENEEPMETDQNAKEEEKMQVDQEEPHVEEQQQQTPAENKAESEEMETSQAGSKDKK

MDQPPQCQEGKSEDQYCGPANRESAIWQIDREMLNLYIENEGKMIMQDKLEKERNDAKNAVEEYVYEMRDKLSGEYEKFV

SEDDRNSFTLKLEDTENWLYEDGEDQPKQVYVDKLAELKNLGQPIKIRFQESEERPNYLKN

>Pan_paniscus

MSVVGIDLGFQSCYVAVARAGGIETIANEYSDRCTPACISFGPKNRSIGAAAKSQVISNAKNTVQGFKRFHGRAFSDPFV

EAEKSNLAYDIVQLPTGLTGIKVTYMEEERNFTTEQVTAMLLSKLKETAESVLKKPVVDCVVSVPCFYTDAERRSVMDAT

QIAGLNCLRLMNETTAVALAYGIYKQDLPALEEKPRNVVFVDMGHSAYQVSVCAFNRGKLKVLATAFDTTLGGRKFDEVL

VNHFCEEFGKKYKLDIKSKIRALLRLSQECEKLKKLMSANASDLPLSIECFMNDVDVSGTMNRGKFLEMCNDLLARVEPP

LRSVLEQTKLKKEDIYAVEIVGGATRIPAVKEKISKFFGKELSTTLNADEAVTRGCALQCAILSPAFKVREFSITDVVPY

PISLRWNSPAEEGSSDCEVFSKNHAAPFSKVLTFYRKEPFTLEAYYSSPQDLPYPDPAIAQFSVQKVTPQSDGSSSKVKV

KVRVNVHGIFSVSSASLVEVHKSEENEEPMETDQNAKEEEKMQVDQEEPHVEEQQQQTPAENKAESEEMETSQAGSKDKK

MDQPPQAKKAKVKTSTVDLPIENQLLWQIDREMLNLYIENEGKMIMQDKLEKERNDAKNAVEEYVYEMRDKLSGEYEKFV

SEDDRNSFTLKLEDTENWLYEDGEDQPKQVYVDKLAELKNLGQPIKIRFQESEERPKLFEELGKQIQQYMKIISSFKNKE

DQYDHLDAADMTKVEKSTNEAMEWMNNKLNLQNKQSLTMDPVVKSKEIEAKIKELTSICSPVISKPKPKVEPPKEEQKNA

EQNGPVDGQGDNPGPQAAEQGTDTAVPSDSDKKLPEMDID

 Etc...

Teremos que baixar também uma sequência de HSP70 de um organismo não relacionado aos primatas e acrescentar no nosso arquivo de sequências. Escolheremos a HSP70 do sapo africano Xenopus laevis.

Hsp70 protein [Xenopus laevis]

647 aa protein

Accession: AAH78115.1 GI: 50415517

Com todas as sequências editadas e copiadas para o clipboard, podemos ir ao programa ClustalW2( http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) e colar na caixa de diálogo. Basta agora pressionar o Submit.

O resultado apresenta quatro abas, sendo a da tela aquela que mostra o alinhamento. Para ver a árvore clique em Guide tree. Role a tela e abaixo das primeiras informações vai aparecer Phylogram. Aí, se o Java estiver habilitado no seu computador, você poderá ver vários tipos de árvores. Nenhuma delas é realmente bonita...

Para ver árvores mais elegantes, é precisosalvar o arquvi que gera as árvores. Clique na aba Guide tree e depois em Download guide tree (com o botão direito) e salve o arquivo (a extensão será .dnd)onde possa recuperar depois. Este arquivo será lido pelo Treeview.

Finalmente, para ver a árvore (dendrograma indicando as distâncias genéticas entre as sequências),é preciso instalar o programa Treeview. Ele pode ser baixado para Eindows Vista ou posterior do link http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview/1.6.6/setup.exe

Instale o programa no seu computador. Não sabemos se funcionará num tablet.

Ao abrir o programa, é preciso escolhe File --- Open e procurar onde o arquivo . dnd gerado pelo ClustalW foi gravado. Quando abrir, várias opções de árvores estarão disponíveis. Experimente todas elas.

Procure identificar cada espécie (use o Google) e veja se a árvore faz sentido. Depois inspecione as sequências escolhidas e veja se alguma parece estranha: muito curta ou muito longa em relação às demais. Retire as sequências discrepantes e repita o ensaio.

Nova referência bibliográfica

Caros alunos.

O livro abaixo

Biologia Molecular - Princípios e Técnicas , publicado recentemente (2012), é bastante adequado  para a disciplina.

Os autores são MICHAEL M. COX; JENNIFER A. DOUDNA; MICHAEL ODONNELL, e a editora é a ArtMed.

Para uma avaliação preliminar listo a seguir o índice do livro

PARTE I - Fundamentos

Capítulo 1. O Estudo das Moléculas da Vida

Capítulo 2. DNA: O Depósito da Informação Biológica

Capítulo 3. As Bases Químicas das Moléculas Envolvidas no Fluxo de Informações

Capítulo 4. A Estrutura das Proteínas

Capítulo 5. Função Proteica

Capítulo 6. Estrutura do DNA e do RNA

Capítulo 7. Estudando Genes

PARTE II - Métodos e Estrutura do Ácido Nucleico

Capítulo 8. Genomas, Transcriptomas e Proteomas

Capítulo 9. Topologia: Deformações Funcionais do DNA

Capítulo 10. Nucleossomos, Cromatina e Estrutura Cromossômica

PARTE III - Transferência da Informação

Capítulo 11. Replicação do DNA

Capítulo 12. Mutação e Reparo do DNA

Capítulo 13. Recombinação Homóloga e Reparo do DNA

Capítulo 14. Recombinação Sítio-específica e Transposição

Capítulo 15. Síntese de RNA Dependente de DNA

Capítulo 16. Processamento de RNA

Capítulo 17. O Código Genético

Capítulo 18. Síntese Proteica

PARTE IV - Regulação

Capítulo 19. Regulação do Fluxo de Informação

Capítulo 20. A Regulação da Expressão Gênica em Bactérias

Capítulo 21. A Regulação Transcricional da Expressão Gênica em Eucariotos

Capítulo 22. A Regulação Pós-transcricional da Expressão Gênica em Eucariotos

Apêndices

Organismos-modelo

Glossário

Soluções dos Problemas

Índice

Resultados da primeira avaliação de Genética Molecular

Amélia Albuquerque	3,6
Ana Cecília	4,0
Ana Janaína	6,4
Ana Milena	5,9
Barbara Leonor	4,5
Bruno César	4,1
Carla Karine	4,3
Célio José	4,5
Clovis Cardoso	2,8
Fernanda Veríssimo	2,4
Filipe Ferreira	3,7
Flávia Maria	2,9
Guilherme Higino	3,7
Handerson Costa	2,6
Hugo Rafael	6,6
Jéssica Josefa	3,0
João Carlos	7,1
Júlia de Santana	4,9
Karine Maria	4,9
Karolliny Amanda	2,4
Kika Watanabe	2,6
Leonardo Lemos	5,7
Leonardo Manghi	3,9
Leticia de Assis	4,0
Ligia Rosa	5,2
Lorrayne Gabriele	3,5
Marcos Antônio	6,7
Maria Gorete	3,1
Maria Jéssica	6,4
Maxwell do Nascimento	4,6
Natalia Gessica	2,9
Natassia Javorski	4,1
Nathalia Gama	6,4
Nayana Buarque	3,8
Polyana Vieira	3,5
Priscila Correia	5,7
Rafaella Pinto	3,5
Raissa Moraes	5,5
Raissa Muniz	4,1
Rebeka de Oliveira	2,5
Rodrigo Bezerra	3,6
Romero Luis	3,7
Thallittia	5,3
Walter de Paula	3,9

O gene "esquecido" nas plantas transgênicas: mentiras e verdades

Caros leitores, mais uma vez temos uma informação sobre transgênicos circulando na internet que não corresponde à verdade. Os órgãos reguladores (CTMNio e seus correspondentes mundo afora), desde o início da avaliação de riscos das plantas transgênicas, sempre se preocuparam com ORFs (pequenos trechos de DNA que podem ser potencialmente traduzidos em proteínas) criadas pela inserção da construção transgênica. Podevin e Du Jardin mostraram que há uma série de ORFs teóricas dentro do promotor do vírus do mosaico da couve flor, que é empregado em várias variantes nas construções de transgênicos. Todos os avaliadores de risco já sabíamos disso, mas ocorrem duas coisas importantes:

a) estas ORFs são muito pequenas e, consequentemente, a proteína expressa será, na verdade, um pequeno polipeptídeo, com altíssimas probabilidades de não ter função alguma.

b) elas não têm um promotor a partir da qual pudessem ser expressas. Na verdade, elas fazem parte de um promotor (o tal pCMV35) que vai permitir a expressão do gene clonado. Assim, é altamente improvável que venham a ser expressas nas células da planta transgênica.

Por isso, nunca se deu qualquer ênfase a elas, pois não há uma "rota ao dano" que possa ser estabelecida se não há expressão dos segmentos gênicos das ORFs. Numa abordagem teórica os autores Podevin e Du Jardin concluem, por outro lado, que não há similaridade com alérgenos nem com toxinas. Portanto, ainda que fossem expressas, não causariam qualquer dano ao homem ou aos animais que consumissem produtos onde estivessem presentes.

Quanto à ligação com o tal gene VI, é um artifício de retórica. As ORFs teóricas estão em quadros de leitura diferentes do gene VI e, portanto, os pequenos peptídeos eventualmente produzidos não têm semelhança alguma com a proteína codificada pelo gene VI (a P6 viral). Por fim, o artigo não coloca em questão os trabalhos dos avaliadores anteriores nem sugere que os possíveis peptídeos sejam perigosos.

Para os que quiserem exercitar seus conhecimentos de BLAST e ORF Finder, o genoma tem 8.024 pares de bases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001497.1) e o segmento gênico de interesse se chama reading frame (VI), cuja sequência gênica pode ser encontrada no link acima. Verão que há seis pequenas ORFs, em quadros de leitura 5´-3´, mas diferentes do quadro de leitura original. A maior delas codifica teoricamente um peptídeo de apenas 87 aminoácidos, que tem baixíssima similaridade com apenas quatro proteínas do banco de dados do NCBI. Como exercício, podem blastar as ORFs menores.

Por que a mentira pelo lado dos "ambientalistas"?

Primeira avaliação Genética Molecular – 2º sem. 2012 28/01/2013 (gabarito e comentários)

1.       (1,5 ponto) - O surgimento da vida na Terra parece ter sido rápido, cerca de 600 milhões de anos após o resfriamento. Mas o estabelecimento de formas de vida diferentes de simples unicelulados levou quase 3 bilhões de anos. Comente como o reparo de DNA pode ter contribuído para esta demora.

O que importa frisar aqui é a perda de informação genética causada pelo meio ambiente e o papel do reparo na manutenção desta informação.

2.       (1,0 ponto)- Ligue os elementos da coluna da esquerda (enzimas do replicossomo de E. coli) com os da esquerda (suas funções).

1	DNA pol III		( 5 )	Auxilia a abertura do DNA relaxando a tensão acumulada nas voltas acima da forquilha de replicação
2	Helicase		( 4 )	Retira os primers e ressintetiza pequenos trechos de DNA, com revisão
3	Primase		( 2 )	Auxilia a quebra das pontes de hidrogênio e separação das fitas, dentro da forquilha de replicação
4	DNA pol I		( 3 )	Adiciona iniciadores de RNA para a síntese da fita contínua e para cada fragmento de Okazaki da fita descontínua
5	Girase		( 1 )	Sintetiza os fragmentos mais longos de DNA e faz revisão da síntese

3.       (1.0 ponto) Na replicação do DNA linear de Streptomyces, um procarioto, o DNA se circulariza pela ligação de suas extremidades. Porque a bactéria faz isso?

O importante aqui é enfatizar o “problema das pontas” e comentar porque o círculo resolve isso.

4.       (1,0 ponto) Os promotores bacterianos clássicos têm uma estrutura conservada. Qual das características abaixo NÂO FAZ PARTE desta estrutura.

a) uma caixa TATA na posição -10

b) o distanciamento de aprox. 20 pb entre duas caixas de consenso

c) um sinal de iniciação da transcrição em torno da posição +1

d) uma caixa com sequencia conservada na posição -35

e) ausência de conservação de sequência entre caixas de consenso

5.       (1,0ponto) Genes eucariotos costumam ter segmentos relativamente longos que serão posteriormente retirados do mRNA maduro. Outros processos são também necessários para gerar o mRNA e localizá-lo junto aos ribossomos. Ligue os elementos da esquerda com os da direita nas colunas abaixo

1	Poliadeninação		(3 )	Retira os introns
2	“capping”		(4 )	Indispensável ao posicionamento do mRNA
3	Splicing		(1 )	Adiciona sequências de adenina na extremidade 3´do mRNA
4	Transporte para o citoplasma		( 2)	Adiciona a base 7-metil-guanosina na extremidade 5´do mRNA
			(   )	O processo ocorre no citoplasma

Obs: Todos os processos ocorrem no núcleo ou na sua membrana.

6.       (1,0) Porque aminoácidos mais frequentemente empregados na síntese de proteínas têm mais códons?

Pois isso reduz a chance de que a mutação sobre o códon modifique o aminoácido respectivo. Outra forma de dizer seria: porque aumenta a incidência de mutações silenciosas (mas é uma forma indireta de esclarecer a questão)

7.       (1,0 ponto) O mecanismo de vazamento do operon lac garante seu funcionamento porque:

a)  permite um suprimento basal de b-galactosidase, essencial para manter níveis de ATP mínimos na célula;

b)  permite uma síntese de pequenas quantidades de permease que garante a entrada na célula da lactose, indutor do sistema;

c)  permite a eficiente degradação da lactose que entrar na célula, antes mesmo da síntese de novo de beta-galactosidase;

d)  permite que a produção do repressor seja interrompida pela entrada de pequenas quantidades de lactose;

e)  permite que a degradação do repressor ocorra sempre que houver lactose no meio de cultura.

8.       (1,0 ponto) Indique se as afirmações sobre as várias etapas de regulação gênica em eucariotos são verdadeiras (V) ou falsas (F).

a) a alteração da cromatina é irrelevante (_F_)

b) a formação do complexo transcricional é a etapa mais importante no controle da expressão gênica (_V_)

c) no processamento do mRNA o splicing alternativo é responsável pela expansão do proteoma (_V_)

d) após a produção do mRNA, a célula obrigatoriamente produzirá a proteína codificada (_F_)

e) a partir de um mRNA maduro pode-se produzir proteínas distintas por processamento da cadeia polipeptídica original (_V_)

9.       (1,5 pontos) Assinale V para verdadeiro e F para falso: Gabarito será anexado posteriormente

(       )	A expressão de genes envolvidos na manutenção de células em eucariotos é de regulação constitutiva;
(       )	O processamento alternativo é um tipo comum de controle ao nível de DNA, que permite gerar uma maior variabilidade de proteínas;
(        )	Elementos regulatórios em eucariotos podem ser proximais ou estar situados a certa distância do gene estrutural;
(        )	Na remodelação da cromatina os nucleossomos são movimentados de forma a disponibilizar as regiões regulatórias, permitindo a transcrição;
(        )	Resíduos de aminoácidos de uma proteína interagem com bases do DNA pelos sulcos da dupla hélice;
(        )	Isoladores impedem que a expressão de um gene contamine a expressão de outro gene vizinho;
(        )	A síntese de ferritina, proteína de estocagem de Fe, é regulada ao nível transcricional e depende da disponibilidade de Fe;
(        )	A edição de RNA é um controle pós-transcricional;
(        )	Quando fatores de transcrição se ligam aos silenciadores, a transcrição de genes que eles controlam é reprimida;
(        )	No processamento alternativo um intron não retirado pode se tornar exon.

Calendário das atividades finais da disciplina Genética Molecular – 2º. sem. 2012

16/01	Síntese proteica
21/01	Controle da expressão gênica em procariotos
23/01	Controle da expressão gênica em eucariotos
28/01	1ª. avaliação
30/01	Clonagem gênica – construção de bibliotecas genômicas
04/02	Clonagem gênica – construção de bibliotecas de expressão
06/02	Aplicações em pesquisa e indústria
11/02	Feriado - Carnaval
13/02	Feriado - Carnaval
18/02	PCR – fundamentos
20/02	PCR –aplicações
25/02	RAPD, sequenciamento e outras técnicas – parte I
27/02	RAPD, sequenciamento e outras técnicas – parte II
04/03	2ª. avaliação
06/03	Distribuição dos genes nos genomas – introdução e genomas virais
11/03	Distribuição dos genes nos genomas – procariotos
13/03	Distribuição dos genes nos genomas – eucariotos e organelas
18/03	Prática – estudo online de genes e genomas – Parte I
20/03	Prática – estudo online de genes e genomas – Parte II
25/03	Prática – estudo online de genes e genomas – Parte III
27/03	Feriado - Semana Santa
01/04	Prática – estudo online de genes e genomas – Parte IV
03/04	Prática – estudo online de genes e genomas – Parte V
08/04	Prática – estudo online de genes e genomas – Parte VI
10/04	3ª. avaliação
15/04	Revisão geral da disciplina – aula tira-dúvidas
17/04	Avaliação de reposição
22/04	Revisão geral da disciplina – aula tira-dúvidas
24/04	Avaliação final
29/04	Segunda chamada da avaliação final