A figura abaixo mostra o contexto genômico da sequência que contém um gene de alfa actina
(ACTA1) de Homo sapiens e a
distribuição de exons ao longo do gene, assim como os introns, como consta da
página do gene. A partir da figura, responda:
Q1) O que você pode dizer da densidade de genes nesta
região? (Justifique sua resposta com os números da figura). Ela está de acordo
com o esperado para um cromossomo de mamífero?
Olhando a escala acima da figura que mostra a região, pode-se
calcular que há mais de 220.000 pb para 6 genes, o que dá um gene para cada 36.000
pb. Esta densidade é muito mais baixa que o de uma bactéria, que está na faixa
de um gene para cada 1.000 pb e é característica dos eucariotos complexos,
especialmente mamíferos.
Q2) Quantos exons estão representados na figura? Este
arranjo de exons e introns é típico de um gene eucarioto de organismo complexo?
(Justifique sua resposta)
Sete exons (indicados em verde escuro), que correspondem aos
seis introns mostrados mais abaixo. Olhando a escala o gene tem pouco menos de
3.000 pb e, portanto, é relativamente pequeno. Há apenas um intron grande, os
outros são pequenos. Neste sentido, ele não é bem típico dos genes de
eucariotos complexos, que têm longos introns em comparação com os exons.
A figura a seguir
contém um conjunto de informações colhidas da página de nucleotídeo
correspondente à parte da sequência genômica acima, desta vez contendo
exclusivamente o gene ACTA1, denominada NC_000001. A partir da figura,
responda:
Q3) Qual o tamanho do gene (em pares de base)? Como você
encontrou este valor? Porque ele não coincide com o tamanho do lócus? O que
provavelmente são as regiões excedentes?
2852 pb. Este valor pode ser obtido da diferença entre a
última e a primeira base do gene + 1 base. O gene é menor do que o lócus porque
este último contém bases antes e depois do gene, provavelmente representando um
pequeno trecho das regiões intergênicas que flaqueiam o gene.
Q4) Porque o gene e o mRNA têm o mesmo tamanho? Tem que ser
sempre assim ou pode ser diferente em outros grupos de seres vivos?
Este gene foi definido a região que começa onde começa o mRNA
e termina onde este termina. Assim, o gene corresponde, rigorosamente, ao
transcrito primário (o mRNA + introns). Esta é uma definição possível de genes.
Para os procariotos o gene geralmente é definido como a ORF...
Q5) Porque o mRNA está representado pela união de vários
segmentos? O que eles representam? A que isso corresponde na figura anterior?
Porque o mRNA dos eucariotos superiores geralmente é formado
pela retirada dos introns, gerando um conjunto de exons que devem ser unidos.
Cada par de números separados por dois pontos é, portanto, um exon, que
corresponde a um bloco verde na primeira figura.
Q6) Porque o CDS não inicia nem termina no mesmo lugar do
mRNA? O que são estas diferenças e quais seus valores em pares de base?
O CDS nunca inicia nem termina nas extremidades de um mRNA. O
códon de iniciação da tradução está sempre um pouco mais para dentro do mRNA e
o códon de terminação da tradução também não é o último. Sempre há, portanto,
duas extremidades não traduzidas no mensageiro, conhecidas com regiões 5´-UTR
(no início do mRNA) e 3´-UTR (no fim do mRNA). Da base 429 a 1409 é
a 5´-UTR, que tem portanto 981 pb. Da base 3025 a 3279 é a 3´-UTR, com 255 pb.
A próxima figura
mostra informações selecionadas da página de proteína da actina. Observe com
atenção os dados e responda:
Q7) A proteína necessita todos os códons potencialmente
codificados na ORF (ou cds) da figura anterior para ser produzida? Por que?
A proteína tem seus aminoácidos codificados pelos códons
(conjunto de 3 bases) da ORF no mRNA, menos pelo último códon, que é o códon de
terminação da tradução e não leva à incorporação de um aminoácido na sequência
da proteína.
A próxima figura
mostra graficamente o encontro das sequências semelhantes ao gene da actina
humana, como obtido pelo uso do blastn contra o banco de dados de nucleotídeos.
A partir das informações mostradas na figura, responda:
Q8) Porque o mRNA do ser humano aparece formando trechos
semelhantes ao gene, intercalados de trechos sem similaridade?
O mRNA não tem introns (que são seis) e, portanto, sua
sequência só alinha com os exons do gene. Por isso há seis linhas finas,
correspondentes aos espaços dos introns entre as regiões do mRNA que alinham
com o gene (seis exons em vermelho e o último em violeta).
Q9) Considerando os resultados para os mRNAs de outros
mamíferos apontados na figura, o que se pode concluir da organização deste gene
nestas espécies? Por que?
Concluímos que este gene está organizado de forma similar nas
várias espécies apontadas porque todos os mRNA têm o mesmo número de
exons e seus tamanhos também são muito semelhantes.
A figura abaixo mostra algumas informações
colhidas do blastn, desta vez do mRNA
da alfa actina humana. Os alinhamentos mostram que muitos mRNA tem elevada
semelhança com o mRNA humano, mesmo no caso de um roedor(Octodon) e da baleia(Orcinus), os últimos clipados na tabela. Responda:
Q10) As antepenúltima e penúltima sequências (para cão e
roedor) têm a mesma porcentagem de similaridade (92%), mas scores muito
diferentes. Porque?
Porque o score é dependente do número de bases ou aminoácidos
que estão sendo comparados, além dos acertos, erros e gaps. Na sequência do cão
a cobertura é bem maior do que na sequência do roedor (98 contra 75%), logo ela
é mais longa, o que, mantendo a mesma similaridade, dá mais pontos de acerto e,
portanto, um score maior.
Q11) Observe abaixo o dendrograma obtidos das sequências de
mRNA; o que podemos dizer da separação
dos primatas e dos demais grupos?
Os primatas estão bem separados de todos os demais grupos,
embora haja certa confusão entre estes últimos: há dois grupos de roedores
separados em chaves distintas e o esquilo acabou agrupado perto dos coelhos.
Não é um bom filograma, de jeito nenhum, mas podia ser muito pior se fosse
feito com a proteína, como mostrado na figura da questão seguinte.
Quando, no lugar
de uma sequência de DNA, empregamos a sequência de aminoácidos da actina no
blastp, observamos imediatamente que as sequências são muito semelhantes. Veja
o resultado retirado deste blast, que mostra a primeira linha da comparação de
sequências entre a actina humana e a da rã; veja também, logo a seguir, uma
parte do filograma construído com as sequências encontradas. Em seguida
responda as perguntas:
Q12) Na comparação
das duas sequências aparece uma terceira linha. O que representa cada uma delas
(o blastp foi feito com a sequência da actina humana)? O que são os espaços em
branco entre elas e os sinais de +?
A linha de cima representa a sequência que foi enviada para o
blastp (neste caso, o gene da actina humana). É o que se chama “query”. A
terceira linha representa a sequência encontrada, neste caso a actina de rã. O
encontro é sempre chamado de “subject”. A linha de meio mostra apenas a
comparação entre elas: quando as duas sequências têm o mesmo aminoácido na
posição em análise, repete-se a sigla do aminoácido. Quando são diferentes, mas
têm propriedades físico-químicas semelhantes, aparece um sinal de +. Por fim,
quando os aminoácidos são totalmente distintos, resta um espaço em branco.
Q13) Quando olhamos o
trecho do filograma, o que podemos dizer da adequação desta sequência para
inferir relações filogenéticas entre vertebrados? Por que?
Há um embaralhamento completo das espécies e, evidentemente, esta
sequência de aminoácidos não se presta à análise filética, ao menos de
vertebrados. A razão é que, sendo muito conservada entre distintas espécies, a
proteína varia pouco em sequência de aminoácidos e os poucos aminoácidos
diferentes entre as espécies próximas (vertebrados, neste caso) não permitem a
construção da árvore (ou dendrograma), que depende muito destas diferenças.
Por fim, se
quisermos investigar a maneira como se encontra o quadro aberto de leitura (ORF
ou cds) no mRNA, podemos observar outra vez o mRNA da actina. A figura ao lado
é o mRNA depositado no NCBI. Observe também o resultado do ORF Finder na figura
abaixo e responda às perguntas:
Q14) A região 3´UTR está completa? Por que?
Está completa porque se pode observar a cauda poliA, que é
adicionada sempre no fim do mRNA e, portanto, no fim da 3-UTR.
Q15) Qual deve ser a ORF correta? Por que?
A primeira. Porque é a maior dentre as que têm quadro de
leitura positivo. A grande ORF na quarta barra está no quadro -1 (é a primeira
da tabela à direita), mas ela implica na tradução do mRNA no sentido 3´- 5´, o
que não ocorre nunca. (Em caso de dúvida, era só ver qual delas tem um
comprimento que dá 377 aminoácidos + 1 códon: dividindo 1134 por 3, chegamos a
378. Heureka!)
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