Contribuição de Nayara e Gustavo
(Este texto precisa de grande revisão para atingir profundidade e clareza necessárias – PPA)
PCR – Aplicações
A técnica da reação em cadeia de polimerase (PCR), se baseia em princípios básicos da biologia molecular como: A termo-estabilidade do DNA; A replicação semi-conservativa; O pareamento de nucleotídeos; O comportamento da DNA polimerase perante um prime; A atuação de íons magnésio como cofatores. Foi desenvolvia com o objetivo de amplificar sequencias de DNA de interesse e hoje é uma técnica amplamente utilizada para fins médicos, forenses, de pesquisa.
Maiores informações sobre a técnica PCR no seminário específico.
Vantagens:
*A alta sensibilidade da técnica permite trabalhar com quantidades ínfimas até mesmo na ordem de fentogramas de DNA/RNA molde.
* Requer menos tempo que a clonagem via bacteriana para a produção de fragmentos.
* Aumento exponencial da quantidade de DNA – sendo a quantidade de DNA duplicada a cada ciclo (até certo limite pois a curva de crescimento tende a se estabilizar devido ao aumento de concentração de DNA e ao desaparecimento dos nucleotideos livres). Com isso, fornece a quantidade de fragmentos necessária para a analise em eletroforese, em um intervalo relativamente curto.
* Aplicável em organismos mortos. Uma vez que a amplificação ocorre in vitro, e depende apenas da amostra genética coletada, não do complexo enzimático do organismo (algumas das limitações do trabalho com organismos mortos a muito tempo serão comentadas mais adiante).
*Permite trabalhar com material não-puro em relação ao DNA alvo, pois utiliza primers específicos que só pareiam com a seqüência de interesse, contudo a amostra deve ter um certo grau de pureza em relação a de outras macro-moleculas.
Desvantagens:
* Facilidade de contaminação: Devido a sua alta sensibilidade, os fragmentos de amostras anteriormente trabalhadas (amplicons na forma de aerossóis) podem vir a serem amplificados no processo.
Para reduzir o risco de contaminações são fundamentais os seguintes cuidados:
◦ A separação física em dois laboratórios “pré-PCR” e “pós-PCR”, de modo que cada um tenha o máximo de independência possível (centrifuga, fonte de água, freezers, refrigeradores e sobre tudo ponteiras, pipetas e batas próprias)
◦ Descarte de ponteiras e tubos utilizados.
◦ Controle do fluxo de pessoas, também de visitantes externos, mas principalmente do pessoal que pode transitar de um laboratório para o outro. O maior risco de contaminação é através dos amplicons (fragmentos de DNA) produzidos no laboratório pós “PCR” e transportados pelos experimentadores ate o laboratório de “pre-PCR”.
* Demanda mão de obra especializada. Uma pessoa não qualificada, na manipulação do processo, poderia facilmente cometer erros e contaminar amostras, gerando assim transtornos morais e financeiros com resultados incorretos, pois a PCR requer atenção permanente cuidado nas práticas laboratoriais.
* Limite do tamanho do fragmento amplificado, para as aplicações listadas neste trabalho tal fato não costuma ser um problema, porém a limitação do tamanho das seqüências impossibilita que se possa clonar um genoma ou cromossomo. Normalmente o tamanho Maximo do fragmento e 5 kb.
*Necessidade de alguma informação sobre a seqüência nucleotídica do fragmento que se pretende amplificar para que seja possível desenhar os primers. Por isso são necessários os estudos sobre seqüenciamento gênico, eles fornecem dados preciosos que são disponibilizados ao público em bancos de dados como o do NCBI.
*Em alguns casos é necessário que haja um processo de purificação (como na detecção de GMOs, por exemplo), A presença de outros materiais (lipídeos, proteínas, amido, celulose, etc.) em grande concentração impede a atuação da polimerase.
Áreas de aplicação: podem ser divididas em médicas, forenses, pesquisa e comerciais:
Diagnósticos de doenças infecciosas:
O diagnóstico de doenças infecciosas tem como principio a detecção do patógêno ou de sua ação. Durante muito tempo apenas os métodos microbiológicos de cultivo e bioquímicos eram utilizados para o diagnóstico, porém os mesmos exigem que se trabalhe com organismos vivos, e de cultura conhecida, além da demanda por tempo que pode levar dias.
Porém com o advento da PCR já não é mais necessário esperar o crescimento microbiano para identificar o microorganismo, fato que é particularmente importante perante situações de emergência e casos de infecção aguda. Além disso, a eliminação da necessidade de cultura é bastante útil quando tratamos com organismos que não dispões de métodos conhecidos de cultivo (bacilo deda doença de Whipple, por exemplo. Organismos frágeis, podem ser danificados na coleta ou no transporte, não crescendo no meio de cultura, quando falamos em PCR isto pouco importa.
Embora na maioria das vezes seja desejado a detecção de uma espécie, podemos em alguns casos trabalhar no nível de subespécie ou gênero.
No exemplo a seguir tomamos o HPV (vírus de DNA, 7904 Kb) como modelo ilustrativo, o exame papanicolau é capaz de fornecer o diagnóstico indicando a presença ou ausência da infecção por HPV. Porém, muitas vezes é necessário saber qual das variações o paciente porta, pois algumas são mais virulentas que outras, e para isso é comum a aplicação da PCR da forma como iremos explicar abaixo.
Fig 1.1 Genoma do papiloma vírus humano, os genes “E” são os expressos mais cedo no ciclo viral, os genes “L” são expressos tardiamente.
1- Coleta do material do colo uterino, pelo mesmo procedimento aplicado no exame papanicolau, cujo material biológico é obtido por meio da raspagem com uma espécie de espátula.
2- Em seguida amplificamos o gene alvo L1, com o uso de do primer GP5+/6+ (primer simples, 150 pb)
3- Neste estágio ocorre a análise dos produtos da PCR. Aqui são descritas inúmeras técnicas para confirmação ou tipagem do vírus.
(É justamente aqui que o texto falha lamentavelmente: não há qualquer explicação de como isso pode ser feito, a não ser uma pequena menção na figura - PPA)
Fig. 1.2 Após a amplificação de seqüência do gene L1 via PCR, inúmeras técnicas podem ser utilizadas na tipagem das variedades virais.
Tipagem de tecidos
Antes de detalhar a técnicas moleculares referentes a tipagem dos tecidos,(como se verá, não há qualquer detalhamento posterior) temos que explanar um pouco acerca do que são os Antígenos Leucocitários Humanos (LHAs). Os LHAs são estruturas glicoprotéicas presentes na membrana plasmática das células de defesa, responsáveis pela resposta imune e auto-imune. Essas proteínas de membrana apresentam polimorfismos nas populações, assim como os genes que codificam tais proteínas (mais de 100.000 combinações de aplótipos existentes).
Fig2.1 (Falta elaborar legendas para estas figuras 2.1, 2.2 e 2.3 - PPA)
Todos os seres humanos apresentam dois aplótipos de LHA, isto é, cada um de nós é portador de dois padrões de um LHA específico (fig2.2) - para fins didáticos consideramos os LHA-A, HLA-B e HLA-DR, embora hajam outros.
Fig 2.2
Estes aplótipos são segregados de maneira mendeliana, cada indivíduo recebe um do seu pai e outro da sua mãe (Fig 2.3)
Fig 2.3 padrão de herança de aplótipos
Portanto existem quatro possíveis combinações de aplótipos, e as chances de se ter um irmão com aplótipos totalmente compatíveis é de 25% - Falamos aqui de compatibilidade com ressalva, pois a não-rejeição total só é possível entre gêmeos idênticos, o sistema imune é muito mais complexo que sugere nosso modelo didático, contudo é muitíssimo mais recomendado ter um irmão como doador que um pai, por exemplo.
PCR-SSP
(falta REFAZER, não dei instrução e nunca mais me solicitaram - PPA)
Diagnóstico de doenças genéticas:
Aplicações Forenses
Clonagem:
A PCR é utilizada como uma ferramenta auxiliar na clonagem de DNA onde os fragmentos são ligados a vetores (usualmente plasmídios), que são inseridos em um organismo vivo. Esse procedimento é utilizado na produção de OGMs, terapia gênica e estudos sobre expressão. Contudo nosso foco aqui é a aplicação da PCR, não entraremos em detalhes de assuntos que devem ser tratados separadamente. A figura 3.1 ilustra a relação da PCR na atividade de clonagem gênica.
Fig 3.1 (transformar os passos abaixo numa legenda decente - PPA)
1 –> DNA de um organismo “A”
2 -> Realização da PCR
3 -> Seqüência amplificadas
4 -> Inserção do gene no plasmídeo, por meio da DNA ligase
5 -> Plasmídeo contendo a seqüência de interesse
6 -> inserção do plasmídeo no organismo B
7 -> Multiplicação do organismo e expressão gênica
(Toda a explicação resumiu-se à legenda da figura. Nada se sabe sobre a forma como o plasmídeo se liga ao produto de PCR, por exemplo, nem como se obtém um produto de PCR suficientemente puro para poder clonar no plasmídeo - PPA)
Estudos com aDNA (o que é vital aqui não está absolutamente explicado, a começar pelo título do item: o que é aDNA? Dois parágrafos depoisaparece: DNA ancestral. Aindaassim, o que é isso? – PPA)
Normalmente quando um organismo morre o DNA é degradado pelas suas nucleases. Porém sob condições particulares, como uma rápida dissecação, alta concentração de sais e principalmente baixas temperaturas, as nucleases podem ser degeneradas antes que consiga reduzir o DNA a nucleotídeos simples. Entretanto esse “DNA sobrevivente” continua a sofrer os efeitos da oxidação, radiações, que continuam no longo prazo modificando a estrutura do DNA e dos nucleotídeos em si.
Neste cenário de tendência permanente de despolimerização, temos uma noção do quão difícil é o estudo do DNA ancestral (aDNA),e de quão degenerados estão os fragmentos que são extraídos após milhares de anos.
Com o advento da PCR com o seu revolucionário poder de amplificação o numero e a freqüência de estudos relacionados ao aDNA cresceu rapidamente, entretanto a alta sensibilidade da técnica foi responsável por uma série de estudos publicando resultados falso-positivos devido as contaminações. Assim, os anúncios mais extravagantes, como por exemplo, extração de aDNA a partir de ossos de dinossauros, ou de folha fóssil de milhões de anos foram todos refutados ou simplesmente desconsiderados devido a impossibilidade de replicação. Segundo Willerslev e Cooper “os mais antigos relatos confirmados são datados em 400-600 mil anos todas de sequências bacterianas”.
Então, se o DNA é tão degenerado e não conhecemos as inúmeras seqüências diferentes da amostra, como podemos parear um primer e realizar a PCR? Isso é possível através da inserção de caudas “poli A” nas extremidades 3’ das seqüência, com o auxílio de uma enzima conhecida como terminal transferase. Assim, um primer com seqüência complementar (poli T) hibridiza e amplifica uma seqüência desconhecida (figura 4.1). (Mas que coisa mais absurda! Só há cauda poli-A em mensageiro, que é RNA, nada tem a ver com DNA ancestral!!!- PPA)
Figura 4.1 (legenda!!! - PPA)
Todavia as altas proporções de citosinas e timinas oxidadas em hidantoínas impedem a ação da DNA polimerase e consequentimente inviabiliazam a PCR. Além disso pode ocorrer problemas como o aparecimento de fragmentos amplificados mais longos que qualquer fragmento da amostra original. Isso se da pelo processo de “jumping PCR” onde ocorre a ligação de fragmentos nos primeiros estágios da amplificação.
Não consigo encontrar imagem de jumping PCR
Detecção de OGMs
Com os avanços da tecnologia do DNA recombinante o ser humano passou a ter o poder de alterar diretamente o genoma de vegetais e animais, através da introdução de genes pertencentes a outras espécies, esses indivíduos com genoma recombinado, são chamado de organismos geneticamente modificados (OGMs).
A técnica PCR permite que organismos geneticamente modificados sejam identificados; através da amplificação de sequencias de interesse é possível verificar a presença ou não de genes introduzidos e a vizinhança do inserto (que caracteriza o evento de transformação específico).
A análise inicia com a extração do material, e é seguida da purificação da amostra, visando obter DNA mais concentrado na amostra (para isso, descarta-se: proteínas, lipídeos etc..) e existem muitos protocolos para isso, porém as duas formas principais são: (1) a limpeza do extrato bruto por diferentes agentes químicos, ou (2) a fixação das moléculas de DNA em resina de alta afinidade com o mesmo.
Em seguida é necessário escolher um alvo:
Bem, precisamos antes compreender a estrutura de um construto inserido em um OGM. Na figura 5.1 vemos um construto formado pelo promotor P-e35s, o espaçador hsp70 que atua como íntron, o gene de interesse cry1Ab, e o terminador T-nos.(ver também o texto sobre transgenia,neste blog – PPA, para uma explicação detalhada da função de cada trecho do construto)
Figura 5.1 (Elaborar legenda - PPA)
A figura 5.2 é um complemento da anterior, que desta vez ilustra os alvos possíveis:
Figura 5.2 (Transformar o texto abaixo em legenda. Para clareza, a figura tem que estar em português - PPA)
} Primer vermelho: Pareia dentro do gene, tem como objetivo identificar a presença do transgene, independente do construto utilizado.
} Primer verde: Pareia numa região do espaçador e amplifica parte do gene, tem como objetivo identificar o construto utilizado, pois outra planta pode ter o mesmo transgene e um construto diferente.
} Primer azul: pareia com o promotor e amplifica junto parte do genoma da planta em que o construto foi inserido, tem como objetivo identificar o evento de criação, uma vez que a inserção do construto se dá ao acaso em uma região não discriminada do genoma da planta. Equivale a verificar o “numero de série”.
Temos então o padrão de bandas na figura 5.3
Figura 5.3 (Elaborar legenda – PPA)
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