Contribuição de Daniel R.C. Araújo
(este texto, apesar da longa gestação, ainda está muito aquém do que deve ser. As falhas mais graves estão indicadas- PPA)
Introdução
O século XX presenciou uma verdadeira explosão do conhecimento sobre biologia molecular. Esta nova ciência tem demonstrado mais claramente do que nunca que toda a vida na terra está relacionada: toda criatura viva utiliza DNA e RNA para armazenar e transferir a informação genética, bem como utiliza o mesmo código genético para construir suas proteínas. À medida que houve um maior entendimento dos mecanismos internos da maquinaria hereditária, os cientistas começaram a se perguntar se o material genético e o processo de expressão poderiam ser manipulados (Kreuzer H. & Massey A. 2002).
Esta tarefa mostrou-se relativamente simples visto que o DNA é constantemente manipulado na natureza. Ele é copiado, cortado e religado diversas vezes nas células vivas. Os agentes naturais de manipulação do DNA são enzimas. As tecnologias baseadas no DNA utilizam essas enzimas, que já foram identificadas e purificadas para uso em laboratório (Kreuzer H. & Massey A. 2002).
Enzimas utilizadas pelos biotecnologistas para manipular o DNA e a expressão protéica:
Endonucleases de Restrição – Também chamadas de enzimas de restrição, essas enzimas reconhecem sequências de bases específicas na molécula de DNA fita dupla e clivam o DNA na sequência de reconhecimento, ou próximo a esta, de maneira exata. As endonucleases de restrição mais comumente usadas reconhecem sequências palindrômicas (sequências em que a leitura de ambas as fitas é a mesma na direção 5’ para 3’). As endonucleases de restrição são produzidas por bactéria e supostamente defendem suas bactérias produtoras contra DNAs invasores, tais como bacteriófagos ou vírus bacterianos. Seus nomes indicam o organismo do qual ela foi purificada ( EcoRI – de Escherichia coli, HindIII de Haemophilus influenzae, e assim por diante)
Para clonagem de um determinado segmento de DNA, as enzimas de restrição mais utilizadas são aquelas que geram fragmentos com extremidades de fita simples complementares de até quatro nucleotídeos de comprimento, denominadas extremidades coesivas. Fragmentos de DNA contendo extremidades coesivas complementares podem ser mais facilmente unidos pela DNAligase, que catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre as duas moléculas de fita simples.
Existem certas endonucleases que cortam a molécula de DNA sem criar extremidades coesivas. Essas moléculas de DNA com extremidades cegas podem ser ligadas a vetores que também possuam a extremidades cegas pela DNA-ligase. A presença de extremidades coesivas, no entanto, aumenta a eficiência da ligação e, por isso, extremidades cegas podem ser convertidas a extremidades coesivas pela adição de um pequeno segmento de DNA fita dupla com um “overhang” ou saliência, conhecido como linker de oligonucleotídeo.
DNA polimerases – As DNA polimerases são enzimas que copiam o DNA. Elas sintetizam uma nova fita simples que é completamentar à fita-molde da molécula original, adicionando novos nucleotídeos à extremidade 3’ da fita em crescimento.Para sintetizar o novo DNA, a DNA polimerase necessita obrigatoriamente de uma fita-molde e um Primer .
RNA polimerase – As RNA polimerases são enzimas que lêem uma sequência de DNA e sintetizam uma molécula de RNA complementar. As RNA polimerases precisam de uma sequência especial de bases no DNA molde, chamada de promotor, que lhes sinalize onde começar a transcrição.
DNA ligases – As ligases combinam fragmentos de DNA por meio da formação de novas ligações fosfodiéster entre os fragmentos.
Transcriptases Reversas – As transcriptases reversas lêem uma sequência de RNA e sintetizam uma sequência de DNA complementar. A transcriptase reversa permitiu aos cientistas sintetizar um gene do DNA a partir de um mRNA. Essa técnica é útil para se trabalhar com genes eucariotos, visto que os genes originais são frequentemente divididos em muitos segmentos pequenos separados por íntrons no cromossomo. O RNA mensageiro destes genes sofreu processamento na célula eucariótica (splicing) e os íntrons foram retirados, restando apenas as sequências codificantes. A transcriptase reversa pode converter esse mRNA em um gene “contínuo” formando somente de sequências codificantes de proteínas (éxons).
Além de manipular o DNA fora da célula, os biotecnologistas devem ser capazes de introduzir o DNA manipulado na célula hospedeira de sua escolha e garantir sua estabilidade nessa célula. Para isso precisa-se normalmente de um Vetor, que é o termo usado para descrever qualquer veículo que carrega o DNA para o interior de uma célula hospedeira e nela se multiplica. Plasmídeos e vírus naturais podem ser manipulados para se tornarem eficientes são vetores, pois normalmente já carregam o DNA de uma célula hospedeira para outra e garantem sua manutenção no interior da hospedeira. Um plasmídeo é uma pequena molécula de DNA circular que atua na célula como um minicromossomo. As enzimas celulares de replicação do DNA duplicam o DNA plasmidial da mesma forma que duplicam o cromossomo regular. Então, moléculas de DNA plasmidial são herdadas por ambas células-filha quando a bactéria se divide. Isso significa que, se uma única célula bacteriana absorve uma molécula de DNA plasmidial, todos os seus descendentes também vão conter a molécula. Os genes codificados pelo DNA plasmidial farão parte do seu conjunto de genes, ainda que residam fora do cromossomo bacteriano.
Os plasmídeos podem ser usados em clonagem molecular formando o DNA recombinante, onde um inserto de DNA originado pela clivagem de DNA de interesse é inserido em uma outra molécula de DNA, o vetor (nesse caso o plasmídeo) e esse DNA recombinante (inserto e vetor unidos) é introduzido em uma célula hospedeira pelo processo da transformação; plasmídeos também são usados na transformação de células vegetais, utilizando o plasmídeo Ti do patógeno de plantas Agrobacterium tumafaciens, que iremos debater adiante.
Os biotecnologistas também empregam vírus como agentes de transferência de DNA. Vários vírus normalmente atuam combinando seu DNA com aquele do seu hospedeiro. Os biotecnologistas podem inserir genes de interesse nos genomas desses vírus (sempre adequadamente modificados para não trazer riscos aos técnicos ou ao amniente) e então deixar o vírus levar o novo DNA para dentro da célula hospedeira e recombiná-lo com o DNA do hospedeiro.
Segundo Kreuzer H. & Massey A. (2002), a transformação é a absorção e expressão de um DNA estranho por células bacterianas. Escherichia coli é uma das muitas espécies que não sofre transformação naturalmente (ou a sofre muito raramente). Entretanto, em 1970, foi desenvolvido um processo para aumentar a capacidade das células de E. coli de serem transformadas. O crescimento rápido das células foi interrompido por cloreto de cálcio resfriado e elas foram expostas a altas concentrações de DNA plasmidial. As células foram, então, rapidamente incubadas a temperaturas relativamente altas. Após este tratamento algumas das células expressaram genes codificados no plasmídeo: as células foram transformadas.
Hoje a eletroporação, sistema pelo qual o DNA é rapidamente mobilizado para o interior da célula, tem sido mais utilizado (Zaha A. et al, 2003). Esse método, desenvolvido primeiramente para introduzir DNA em células eucarióticas, tem sido utilizado em E. coli e outras bactérias, que normalmente não se prestam ao tratamento convencional com cloreto de cálcio, e tem resultado em um aumento na eficiência de transformação. O método baseia-se na introdução de DNA em células previamente multiplicadas, resfriadas e lavadas extensivamente com uma solução de baixa concentração salina para reduzir a força iônica da suspensão celular. Essas células ressuspendidas em uma solução de glicerol a 10% são submetidas a um campo elétrico de alta voltagem, que, ao abrir pequenos poros na membrana celular, propicia a entrada do DNA na célula, através dessas aberturas.
Mesmo a transformação realizada com todo o cuidado é muito ineficiente. Somente uma célula em milhões ou mesmo bilhões absorve o DNA plasmidial. Por isso os biotecnologistas utilizam genes marcadores nos plasmídeos. Genes marcadores são genes que produzem um fenótipo facilmente detectável, como a resistência a um antibiótico ou a mudança de cor em certas condições.
Vetores de expressão
Vetores de expressão procarióticos
Em muitos estudos , o gene de interesse clonado é utilizado para gerar o produto gênico (uma proteína). Para esse propósito, o gene deve ser clonado em um vetor de expressão. Vetores de expressão para hospedeiros procarióticos, tais como Escherichia coli ou Bacilius subtilis , são geralmente plasmídeos contendo promotores fortes (promotor é uma região sinalizadora, que indica o inicio da transcrição do gene de interesse); um promotor se diz forte quando a RNA polimerase o reconhece sempre, produzindo grande quantidade de mRNA. Os promotores virais são muitas vezes fortes, pois seus genes precisam ser replicados constantemente; por isso, pesquisadores usam os promotores virais para ter uma melhor eficiência na expressão. Os sítios de ligação ao ribossomo devem estar presentes logo após o promotor e vários sítios de restrição devem estar localizados imediatamente a jusante do sítio ligador de ribossomos, onde clonaremos nosso inserto de interesse. Nesses vetores a proteína de interesse é gerada em grandes quantidades, mas contendo resíduos extras na extremidade amino. Estes resíduos existem porque é necessário garantir um códon de iniciação da tradução que pode não vir com o inserto. Este códon é dado por um pequeno trecho da parte inicial de outro gene, muitas vezes o lacZ, que codifica a beta-galactosidade. Esses aminoácidos extras, geralmente não representam qualquer problema para estudos bioquímicos ou funcionais subseqüentes. A figura a seguir mostra como este vetor está construído, representado antes da clonagem e depois da inserção do DNA de interesse. Na parte final da figura está representada a proteína quimérica, tendo a parte amino-terminal codificada pelo plasmídeo e o restante pelo inserto.
Figura 1: Esquema representativo de um vetor de expressão que emprega parte do operon lac (muito modificado) para garantir a expressão controlada dos insertos clonados no sítio múltiplo de restrição (MRS). O promotor lac é seguido pelo operador para permitir o controle da produção da proteína quimérica. Após o sítio ligador de ribossomo (RBS) inicia-se o gene lacZ (apenas uma perta dele é empregada neste plasmídeo). Dentro do gene lacZ está o poly-linker ou MRS, que permite a abertura do plasmídeo com uma grande gama de enzimas de restrição. Este sítios só aparecem aí em todo o plasmídeo. Depois do gene deve existir um terminador da transcrição (sinal de terminação da transcrição) ou o mRNA irá continuar para além do desejado até encontrar este sinal de outro gene no plasmídeo. Uma vez clonado, o inserto divide o MRS no sítio de restrição escolhido e se encaixa aí, formando uma continuação da primeira parte do lacZ. A cabeça do cavalo é a parte aminoterminal da proteína (NH2), codificada desde o ATG até o poly-linker e cauda da tartaruga a extremidade carboxi-terminal (COOH), codificada pelo inserto.
Vetores de expressão eucarióticos
Os elementos essenciais de um vetor de expressão de mamíferos são essencialmente os mesmos de um bacteriano:
(1) um promotor capaz de proporcionar alto nível de transcrição.
(2) um códon de iniciação da tradução, um poly-linker dentro de um gene ou de um pedaço de gene
(3) um sinal de terminação de transcrição, seguido de um sinal de poli-adenilação.
(4) marca de seleção para preparação de linhagens estáveis de células
(5) origem de replicação de procariotos para possibilitar a propagação do vetor em bactérias.
Pode parecer estranho que o plasmídeo deva se multiplicar em bactérias e não no eucarioto que se pretende transformar. Mas é exatamente assim: toda a manipulação da sequência gênica e das sequências auxiliares (terminadores, etc) é feita em bactérias. Uma vez a construção pronta, ela é retirada do vetor por cortes com enzima de restrição e o segmento é empregado na transformação do eucarioto (uma planta, por exemplo). A figura a seguir mostra um plasmídeo que foi construído para que, com um segmento extraído dele, seja obtido um transgênico eucarioto.
Figura 2: Figura representativa de um plasmídeo carregando uma construção a ser empregada na transformação de um eucarioto para expressão de um gene clonado. O plasmídeo deve replicar numa bactéria, o que facilita e acelera o processo de construção. A marca de seleção deve permitir a seleção do eucarioto que receber a construção depois da transformação, de forma estável. A marca de seleção procariota não está mostrada (em geral é uma resistência a um antibiótico). Entre o promotor e o cDNA muitas vezes se insere um DNA para criar um certo afastamento, que é retirado de um intron. O sinal de iniciação da tradução tem que estar no cDNA, neste caso.
Plantas transgênicas
Na agricultura moderna, onde a monocultura é o que prevalece, milhares de plantas vivem em grande proximidade física, um processo ecologicamente instável, que torna o ambiente agrícola susceptível a invasão de microrganismos patogênicos, plantas invasoras e insetos. Para controlar as plantas invasoras e manter a produção, tanto os pequenos agricultores quanto os grandes produtores rurais adotam o uso de herbicidas e de outros defensivos agrícolas, além de fertilizantes e máquinas agrícolas para plantio direto e outras técnicas que permitem alta produção no campo. Além da luta contra as pragas citadas anteriormente, os agricultores também almejam outros objetivos, como plantas mais resistentes à seca ou encharcamentos, maior resposta ou independência a fertilizantes, tolerância a ambientes hostis, como os solos ácidos, e também o aumento do valor nutricional de culturas de interesse socioeconômico.
Para chegar a esses objetivos cientistas a mais de 50 anos atrás já utilizavam técnicas de cruzamentos clássicos, ou seja, a genética mendeliana aplicada ao melhoramento, onde “melhoristas” trabalhavam com o princípio da diversidade genética quando faziam cruzamentos e da segregação quando selecionam plantas ou animais superiores. Com o surgimento da biotecnologia, o tempo da obtenção das variedades com novas características foi reduzido, e trouxe uma grande vantagem: a de se obter características transferidas de uma espécie que não tem compatibilidade sexual com a variedade melhorada. As barreiras naturais podem ser assim superadas utilizando técnicas moleculares para introduzir genes que expressam característica de interesse.
Técnicas para introdução de genes de interesse em plantas
Genes de interesse podem ser transferidos utilizando uma bactéria causadora de tumores em plantas, a Agrobacterium tumefasciens; esta bactéria tem como característica a capacidade de introduzir parte do seu código genético, chamado T-DNA (figura 3) do plasmídeo bacteriano indutor de tumor (plasmídeo Ti) (figura 4) que será integrado no genoma vegetal e posteriormente expresso causando uma doença chamada Galha-de-coroa (figura 5) (este trecho ainda precisa revisão: o que vem a ser figura 2.2 e 2.3? Mas nem há tempo nem paciência para prosseguir. A figura é muito mais complexa do que o necessário neste caso e será preciso escolher outra)
Fonte: Nature.com
Figura 3. Micro-organismo do gênero Agrobacterium introduzindo parte do seu código genético na célula vegetal.
No entanto podemos inativar esses genes “causadores de tumores” que estão no fragmento T-DNA; esse fragmento é relativamente pequeno (cerca de 25 pb), transferir o T-DNA inativado do plasmídeo para outro plasmídeo bacteriano, e por ultimo ligar nosso gene de interesse ao T-DNA, mantendo as bordas comuns aos T-DNAs das agrobactérias selvagens que são responsáveis pela entrada na célula vegetal. Com essa estratégia oferecida pela própria natureza podemos introduzir qualquer gene em uma célula vegetal. (Isso tudo está lamentavelmente confuso)
Fonte: Apresentação Prof. Magdalena Rossi – Instituto de Biociências
Figura 4. Plasmídeo Ti das agrobactérias, imagem ressalta a região transferida da bactéria para o genoma da planta.
O fragmento T-DNA sintetiza substâncias que serve como nutrientes para as bactérias, as chamadas opinas, a síntese de hormônios responsáveis pelo crescimento provoca grande desequilíbrio no organismo gerando grandes tumores na planta.
Figura 5. Foto de uma planta com a doença Galha-de-coroa.
Esta técnica que utiliza a bactéria Agrobacterium tumefaciens como vetor para transferência do gene de interesse, inativa os genes responsáveis pela doença e se insere a construção quimérica de interesse. (repetido e perdido aqui)
Outra técnica é realizada pelo equipamento eletroporador (figura 3) de protoplastos, protoplastos são células desprovidas de parede celular. Para a transformação os protoplastos são incubados junto com a construção genética, um choque de alta voltagem é realizado por curto tempo ocorrendo uma alteração temporária na membrana celular que permite a entrada dos genes no genoma da planta. (Isso já foi discutido antes, embora com menos detalhes)
(Figura 3) Técnica Eletroporação (Onde já se viu uma legenda assim!)
Uma técnica bastante utilizada também é da biobalística, está técnica consiste na lógica da arma de fogo (figura 4). Microprojéteis de tungstênio ou de ouro são embebidos por genes de interesse que são lançados a aproximadamente 1500 km/h em tecidos vegetais que entram nas células junto com os microprojéteis e se integram ao genoma.
Fonte: apresentação Paulo Andrade/transgenia
Figura 4. Esquema do equipamento utilizado para o método biobalistica.
Fonte: apresentação Paulo Andrade/transgenia
Figura 4.1. Esquema do método biobalística. (é preciso elaborar muito esta legenda)
Uma vez inserido o gene de interesse com seu respectivo promotor, terminador e genes marcadores, vem o desafio de selecionar as células com o gene transgenico, daí cultivar essas células in vitro, depois de se verificar bom andamento em seu desenvolvimento levar para casa de vegetação até se transformar em um indivíduo inteiro.
Microinjeção (figura 5) é o método mais direto e preciso para a inserção de macromoléculas dentro de uma célula ou compartimento celular. Uma técnica que se trabalha principalmente com animais. Para introdução do material genético, usa-se uma pipeta de vidro para segurar a célula e uma espécie de seringa para colocar um fragmento de código genético.
Fonte: www.biotecpragalera.org.b
Figura 5. Método da microinjeção.
Estudos com transgenia
A tecnologia do DNA recombinante constitui uma nova e fundamental ferramenta para o contínuo desenvolvimento de sistemas agrícolas e produção de alimentos. Um estudo desenvolvido em 2003 no Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul onde foram retirados do microrganismo Metarhizium anisopliae genes que expressam enzimas quitinases, e foram transferidos para um genoma vegetal do Nicotiana tabacum, esta enzima ataca as quitinas presentes em muitas pragas como insetos, ácaros e fungos.
A resistência das plantas devido à expressão destas quitinases é explicada por danos causados nas estruturas vitais dos organismos como a cutícula de insetos ou a membrana peritrófica e a parede celular de fungos patogênicos, ou ainda estimular mecanismos de defesa da própria planta devido a estruturas derivadas das quitinases. Outra vantagem é que a quitina não se encontra em plantas, o que garante a especificidade contra insetos invasores e outros predadores.
É valido salientar que fungos como o Metarhizium anisopliae são usados no controle biológico de plantações de cana-de-açúcar, cujo objetivo era permitir que as hifas dos fungos penetrassem nos artrópodes, porém a menos de uma década atrás não existia na literatura nenhuma informação sobre o uso deste fungo como fonte de genes para transformação genética vegetal.
Outros trabalhos abordam sobre a resistência de plantas frente ao Rhizoctonia solani quando estas plantas são transformadas com genes codificadores de quitinases. Este microrganismo está presente no solo e ao infectar uma planta causa o apodrecimento das raízes, ferrugens e necrose das folhas. Seus hospedeiros são plantas de grande interesse social e econômico, são: arroz, tomate, canola, algodão, tabaco e grama.
Outro estudo realizado foi o desenvolvimento do milho Bt-11, pela empresa Syngenta, já aprovado para consumo humano em vários países como a Argentina, Austrália, Canadá, China, Japão, Coréia, Nova Zelândia, Filipinas, Rússia, África do Sul, Suíça, Uruguai e Estados Unidos, somente agora a Comunidade Européia (CE) aprovou o milho geneticamente modificado, Bt-11. Este milho é geneticamente modificado para conferir resistência a um inseto que causa perdas na produção. A CE julgou que o milho Bt-11 é seguro para consumo, como o milho convencional. No Brasil, foi apresentado à Comissão Técnica Nacional de Biosegurança (CTNBio) um pedido para a liberação comercial do mesmo milho Bt-11, no ano 2000.
O pedido de liberação envolve o milho transgênico resistente a insetos e tolerante a herbicida, denominado milho Bt-11, contendo a proteína inseticida Cry1Ab(figura 6), isolada da bactéria Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki cepa HD1 e a proteína herbicida fosfinotricina acetil transferase (PAT), isolada da bactéria Streptomyces viridochromogenes.
Algumas das conclusões dos extensivos estudos apresentados à CTNBio sobre a segurança ambiental e alimentar da linhagem transgênica do milho Bt-11 são apresentadas. Em relação à segurança ambiental, as linhagens de milho transgênico, possuem o mesmo potencial que as plantas de milho não transgênicas, de se tornarem plantas daninhas. A possibilidade de transferência dos transgenes é a mesma do que qualquer outro gene do milho, e ocorre somente em plantas de milho. Devido às características das proteínas produzidas pelas linhagens transgênicas de milho, esta transferência não apresentou impacto negativo ao meio ambiente.
A atividade da proteína introduzida é altamente específica para o controle
de insetos lepidópteros no milho, não tendo sido observado efeitos em outros insetos, aves, peixes, mamíferos e seres humanos. Em relação à segurança alimentar das linhagens transgênicas, as avaliações da linhagem transgênica de milho resistente a insetos foram baseadas nas avaliações da equivalência das composições da linhagem transgênica, comparada com outros materiais de milho. As análises das composições dos grãos e da forragem derivados das linhagens de milho tiveram como base aspectos bromatológicos (incluindo protídeos, carboidratos, lipídeos e resíduos), minerais, bem como nutricionais (ácidos graxos e vitaminas).
Os resultados evidenciaram que os níveis observados nas plantas nas linhagens transgênicas foram equivalentes em quantidade e qualidade, aos padrões de milho convencionais utilizados, além de estarem dentro dos níveis descritos na literatura para as culturas do milho. As proteínas recombinantes presentes no milho foram rapidamente degradadas nas condições presentes no sistema gástrico de seres humanos. As proteínas em questão são desativadas pelo calor, utilizado no processamento do milho. As proteínas em questão não apresentaram propriedades associadas a proteínas alergênicas.
fonte: apresentação Paulo Andrade/transgenia
Como é que pode? Este plasmídeo foi empregado na construção de um ALGODÃO resistente a insetos, não tem nada a ver com o milho.
Referências
ZAHA A. et al. Técnicas de biologia molecular. Zaha A. et al Biologia Molecular Básica. Porto Alegre : Mercado Aberto, 2003. p379
KREUZER H. & MASSEY A. Aplicando a biologia molecular: Tecnologia do DNA recombinante. Kreuzer H. & Massey; trad. Ana Beatriz Gorini da Veiga et al. Engenharia Genética e Biotecnologia. Porto Alegre: Artmed, 2002. p 124
KERN, M.F. Expressão de uma Quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum: Obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas: 2003. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) – Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
MONQUEIRO, P.A. Planas Transgênicas Resistentes aos Herbicidas: Situação e Perspectivas. Bragantia,Campinas, v.64, n.4, p.517-531, 2005
GANDER, E.S; MARCELINO, L.H. Plantas Transgênicas. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. Ano 3 n° 15, p. 34-37 Julho/Agosto 2000
LARAYER, A et al. Biotecnologia. Disponível em http://www.cib.org.br/cd_cib.php 22 de outubro de 2011.
RECH E. Análise do milho Bt-11. http://www.cib.org.br/pdf/artigo_milho_bt11.pdf
26 de outubro de 2011.
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