PCR (Polymerase Chain Reaction) e RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction

Contribuição de Lucas Alencar

(Este texto ainda precisa ser mais elaborado - PPA)

PCR (Polymerase Chain Reaction) e RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction)

A PCR é muitas vezes definida de forma prática como uma técnica, mas é muito mais um método do que uma simples técnica. O método é uma forma de pensar, um conjunto de etapas ordenadas com uma finalidade, enquanto a técnica é um modo operacional, os procedimentos práticos de um determinado método e uma forma de ordená-lo. Com isso, veremos que a PCR pode se desdobrar em várias técnicas que utilizam materiais e substâncias diferentes, técnicas estas que foram desenvolvidas por várias pessoas ao longo de anos, contribuindo com suas ideias para o refinamento das várias técnicas.

Kary Mullis idealizou as bases da PCR em 1983 e em 1987 publicou um artigo que utilizava a PCR para amplificar o gene da b-hemoglobina humana e diagnosticar no pré-natal a anemia falciforme; em 1993, ele ganhou o prêmio Nobel de química por seu invento. Nomeá-lo como único inventor é excluir muitos cientistas que participaram e colaboraram com a descoberta e o melhoramento da PCR, por isso o crédito da descoberta é muitas vezes contestado por estes cientistas que foram “excluídos” dos créditos, o que revela uma injustiça muito comum no mundo da ciência. Apesar do idealizador da PCR ter sido de fato Kary Mullis, quem realmente fez a PCR funcionar foi a sua equipe.

Mullis não teve grandes avanços em purificar a taq polimerase, e David Gelfang, Susanne Stoffel e outros pesquisadores foram os responsáveis pela purificação. Randy Saiki, por exemplo, foi primeiro autor de um artigo publicado na Science sobre aplicações da PCR e também o primeiro autor num artigo anunciando o sucesso com a taq polimerase (9, 10). Mullis, em 1988, deixou a empresa em que trabalhava e virou consultor, sendo os demais pesquisadores de sua equipe, Glenn Horn, Steven Scharf, Henry Erlich e Norman Arnheim, os principais aperfeiçoadores da PCR (10).

Figura 1: Kary Mullis (http://e-ducation.net/biologists.htm)

A tecnologia do DNA recombinante foi um método desenvolvido cerca de 10 anos antes do desenvolvimento da PCR e era bastante utilizado para estudos moleculares e de mapeamento. No entanto as técnicas conhecidas até então eram dependentes da obtenção de uma quantidade relativamente grande de DNA puro, e isso dependia dos plasmídeos e outros vetores durante o processo de replicação dos microrganismos utilizados nessa técnica (1).

O processo da clonagem molecular por microrganismos fazia o uso de enzimas de restrição, e também era necessário construir um plasmídeo de clonagem, unir o fragmento de DNA desejado ao plasmídeo, e depois selecionar os clones desejados (11). Trabalhar com genomas grandes e complexos como o genoma humano, era ainda mais difícil porque tamanha complexidade dificultava ainda mais todo esse processo (3, 2). Outra dificuldade que se tinha era a demora em conseguir uma boa quantidade de DNA, porque isso ficava a mercê da multiplicação dos microrganismos, o que tornava o processo lento e tedioso.

O método da PCR resolveu todos esses problemas de forma simples e elegante, permitindo que o processo de amplificação fosse mais fácil, rápido e produtivo.  Algo curioso sobre o advento da PCR é que quase todos os materiais necessários para realizar a técnica como foi concebida, já haviam sido desenvolvidos e utilizado muitas vezes, como primers, por exemplo, mas o coração da PCR, a taq polimerase, só foi isolada após o advento da técnica, apesar de já ser conhecida, mas não utilizada. Então graças a seus conhecimentos bioquímicos e matemáticos, Kary Mullis, acompanhado de sua equipe, conseguiu idealizar os processos pelos quais o DNA passaria até ser copiado em escala exponencial (4).

Apesar de toda “mágica” da PCR, a técnica passou, e ainda passa, por uma série de modificações e melhoramentos até atingir a qualidade das amplificações modernas. No começo, por exemplo, utilizava-se a polimerase isolada de bactérias da espécie Escherichia coli, mas a temperatura ideal para o funcionamento dessa enzima é em torno de 37ºC (5,6), e quando a temperatura era aumentada para que o DNA desnaturasse, a enzima perdia rapidamente a sua funcionalidade, o que tornava obrigatório a cada ciclo da PCR uma adição de mais polimerase à mistura, aumentando o custo e as chances de contaminação, que poderia levar a uma perda de todo o material (7).

Podemos definir PCR como uma reação que possibilita a obtenção de quantidades muito grandes de fragmentos específicos de DNA através da amplificação em ciclos de qualquer quantidade de DNA obtido de diversos tipos de materiais, como por exemplo, material orgânico, seja ele vivo ou morto, DNA sintético, e até mesmo misturado com outros DNA’s ou com muitas outras moléculas. (8). A reação da PCR é composta por quatro elementos essenciais, além de uma série de reativos e aditivos.

O primeiro elemento seria o DNA molde. Todos os organismos conhecidos até hoje, possuem em sua composição moléculas de DNA, que, ao depender do tipo de material, pode ser extraído por diferentes protocolos, que supostamente irão fornecer um material limpo e livre de quaisquer outros compostos, apesar disso não ser essencial para a PCR, visto que ela amplifica somente o DNA. Teoricamente, o DNA a ser amplificado pode ter entre 50-5.000 pares de base, o que revela uma das principais limitações da PCR, mas na prática é possível sim trabalhar com moléculas maiores e com o peso molecular maior, em que a amplificação é feita com altíssima fidelidade.

O segundo reagente seria o conjunto das bases nitrogenadas (Dinucleotídeos trifosfatados ou simplesmente dNTP’s), que será o material utilizado para a formação de novas cadeias. A quantidade de nucleotídeos a ser adicionada na reação varia de acordo com o tamanho do fragmento a ser amplificado, bem como com a quantidade de material que se deseja amplificar, mas em geral usa-se 200mM de cada nucleotídeo.

Outro reagente necessário são os primers. Primers são oligonucleotídeos com a capacidade de se ligar a uma fita simples de DNA e servir como iniciador da polimerização de uma fita. Um passo importante do sucesso de uma amplificação é o conhecimento prévio de no mínimo um pedaço da sequencia que se deseja amplificar. Com esse conhecimento prévio é mais fácil desenhar primers que complementem especificamente a parte do genoma que será amplificado. Alguns cuidados devem ser tomados ao desenhar primers; um deles é que é interessante que a maior parte das bases nitrogenadas sejam C ou G, visto que a união dessas duas bases com seu complementar se dá por três pontes de hidrogênio e não por duas, como nas bases T e A, o que confere ao primer uma maior estabilidade durante a fase de encontro do primer, que vai determinar a especificidade da reação, e que deve idealmente estar entre 50 e 65 ºC. Outra consideração importante é que os primers não devem ter sequências complementares internas, porque isso pode ocasionar num auto emparelhamento e a formação de grampo, diminuindo a quantidade de primers disponíveis para a reação ou sua inutilização completa. Os primers também devem ser pequenos, entre 17 e 28 bases, produzidos nas direções “forward” e “reverse” e utilizados aos pares; um emparelha com uma parte da fita simples e o outro com outra parte da fita complementar a primeira e ambos trabalham sempre no sentido cinco’->3’.

 

  

Figura 2: Desnaturação e pareamento dos primers. No ponto um, a fita dupla de DNA é desnaturada para que possa ocorrer o pareamento dos primers, em que o forward (3) se junta a fita 3’ e é polimerizada no sentido 5’->3’, enquanto o reverse (2) se junta a fita 5’ e pareia na extremidade 3’ dessa fita para que a polimerização ocorra no sentido 5’->3’.

O último reagente necessário, não em ordem de importância, é a DNA polimerase. Essa enzima é capaz de copiar um trecho de uma fita fazendo uma fita nova simples no sentido oposto, através do emparelhamento de bases nitrogenadas, iniciando no primer e terminando em algum ponto não muito mais longe que 5000 bases. Essa reação de polimerização só é possível pelo fato das bases serem complementares. É um processo que ocorre naturalmente em qualquer divisão celular e sempre acontece no sentido 5’- 3’. 

Figura 3: taq polimerase sintetizando uma fita a partir de um molde (http://www.neb.com/nebecomm/products/productf-540.asp)

No início da utilização da PCR, usava-se, como já foi dito, a polimerase da Escherichia coli, mas pelo fato de não ser uma enzima termoestável, os pesquisadores buscaram isolar a polimerase de alguma espécie que suportasse altas temperaturas; a escolhida foi a DNA polimerase deThermus aquaticus, bactéria que vive em fossas termais, onde a temperatura passa dos 100ºc. A Taq polimerase, como foi batizada, representou um dos maiores avanços no que diz respeito à confiabilidade da amplificação, visto que, por suportar altas temperaturas sem perder a sua conformação nem sua funcionalidade, permitiu que a PCR pudesse ser realizada sem ser necessário adicionar mais polimerase a cada ciclo; como vimos, isto diminui muito a chance de contaminação da reação, além de agilizar em muito o processo.

Além desses quatro compostos essenciais, outros são necessários para que a PCR ocorra com sucesso. O tampão, solução formada por 50mM KCl, 10mM Tris. Cl e 1.5mM MgCl2, que fornece as condições adequadas para atividade da polimerase; particularmente o MgCl2 funciona como um cofator para a atividade da polimerase e pode estar na forma de  MgCl2ou MgSO4 e é utilizado em concentração em torno de 25mM. A água precisa ser estéril, por isso ela é auto clavada e ultrafiltrada. Gradativamente foi-se descobrindo novos composto que funcionariam como aditivos para a reação, dentre eles podemos citar o DMSO, que facilita a separação das fitas de DNA; o Glicerol, que age como estabilizador; e o BSA, que é uma proteína captadora de íons, impedindo que estes atrapalhem o bom funcionamento da taq polimerase. 

COMPONENTE	VOLUME	CONCENTRAÇÃO FINAL
1. DNA molde	1.0µL	100 ng/25 µL
2. dNTPs mix	0.2µL	200 µM
3. primer mix	0.4µL	0.4 µM
4. Taq polimerase	0.2µL	1 Unit/25 µL
5.  10x PCR Buffer*	2.5µL	1x
6. Água autoclavada ultra-filtrada(pH 7.0)	20.7µL	-

Figura 4: reação geral de uma PCR para 30 ciclos (25 µL)

Para juntar todos esses componentes da PCR, se faz necessário, lógico, uma série de máquinas e ferramentas, são elas: pipetadores, ponteiras, eppendorfs, centrífugas, e etc. De acordo com cada protocolo, os instrumentos serão utilizados para um determinado fim, mas no final os eppendorfs, contendo a solução necessária para a polimerização em cadeia aconteça, serão levados a uma máquina que é responsável pelo grande salto que a PCR proporcionou aos estudos genéticos.

O Termociclador é uma máquina que esquenta e esfria a reação em curtos períodos de tempo e justamente por essa sua característica de conseguir realizar mudanças de temperatura quase que instantaneamente, que é possível que o processo de PCR seja rápido e automatizado.  Apesar de várias marcas diferentes produzirem vários modelos diferentes de termocicladores, a base é cemelhante: existe uma placa de metal com espaços adequados para eppendorfs (de 0,2 ou 0,5 µL) com os reagentes da PCR. Quando forem estabelecidos os parâmetros necessários e a quantidade de ciclos, a máquina começa a trabalhar e a PCR de fato se inicia.

Figura 5: Termociclador (http://www.analiticaweb.com.br)

O processo se dá em três etapas por ciclo. O primeiro passo consiste na desnaturação da fita dupla de DNA para convertê-la em uma fita simples. Tipicamente usa-se uma temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos. O segundo passo deve acontecer de forma muito rápida, abaixa-se a temperatura a 55˚C por 30 segundos, para que os primers possam parear com seu respectivo complemento, no entanto, se o pareamento dos primers não for rápido o bastante, a fita de DNA irá renaturar, impossibilitando o terceiro passo. Por isso trabalha-se sempre com grande excesso de primers na reação. Na última etapa, já com os primers emparelhados, o Termociclador eleva a temperaturaa da reação para 70ºC e uma polimerase de DNA estende-os no espaço compreendido entre ambos os primers, adicionando dNTP’s no sentido 5’ - 3’ , nas duas direções, “forward” e “reverse”.

Figura 6: Ciclo da PCR (http://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-RAPD-aplicar.htm#Primeirospassos)

Depois da desnaturação, do emparelhamento e da extensão (polimerização), é finalizado o primeiro ciclo e um segundo se inicia, agora com o dobro do alvo disponibilizado. Após o término do segundo ciclo, temos 4 fitas simples de DNA amplificado, ao término do terceiro, temos 8, no quarto, 16. Percebemos com isso que o processo de amplificação do DNA acontece de forma exponencial e que ao final de 36 ciclos, teremos em torno de 68 bilhões de cópias do pedaço específico do genoma que se deseja trabalhar.

Figura 7: cadeia exponencial da PCR (http://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-RAPD-aplicar.htm#Primeiros passos)

 Quando todo o processo no Termociclador for concluído, é necessário que se faça a detecção do produto para saber se o que foi amplificado era realmente a parte escolhida e se foi amplificada a quantidade desejada. Essa detecção normalmente se faz por eletroforese e dependendo do tamanho da amplificação e da resolução desejada, utilizam-se diferentes meios (agarose, poliacrilamida) e em diferentes concentrações.  Para que ocorra a visualização do DNA no gel é necessário que ele seja corado com alguma substância, por exemplo, brometo de etídio, coloração de prata, fluorescência, radioatividade. Quando estiver corado e o gel for exposto a alguma fonte luminosa as bandas brilham e é possível fotografar para posterior análise.

Figura 8: Amplificação por PCR analisada em gel de agarose corado com brometo de etídio (http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/co/p_co235_f6.htm)

Das várias vantagens que o método da PCR trouxe, podemos citar a velocidade e facilidade do uso; uma técnica que não reque muito conhecimento e que seguindo um protocolo, pode ser facilmente realizada em algumas horas, ao contrário da técnica mais antiga (clonagem em plasmídeo, multiplicação, extração, corte do fragmento desejado com enzimas de restrição, purificação), que podia durar semanas. A PCR também é uma técnica muito sensível sendo capaz de amplificar diminutas quantidades de DNA de qualquer organismo vivo ou morto; a elevada sensibilidade, entretanto, pode trazer problemas de contaminação, mas a robusteza dos resultados compensa esse risco.

Como nem tudo é perfeito, sabe-se que na pratica a PCR não produz tantas cópias como em princípio a teoria indica. Outro problema é que alvos grandes não são amplificados; mas o aprimoramento da PCR já conseguiu amplificar alvos relativamente grandes (até 30 kb) com nenhum, ou quase nenhum erro de duplicação. Outro problema apontado é a necessidade de primers específicos que sejam complementares ao fragmento que se deseja amplificar. No entanto, como já foi dito antes, existem técnicas que permitem a amplificação arbitrária do DNA, que elimina essa exigência. Mas é menos precisa.

Outro grande problema da PCR é a pouca precisão da análise dos resultados. Ao correr as amostras num gel, temos uma limitação muito grande nas análises devido à baixa sensitividade e resolução do gel. Como a visualização das bandas depende do DNA ter sido bem corado, as amostras podem ser perdidas pelo simples fato da banda não estar muito corada e evidente no gel. Como o resultado é comparado de forma muito estimativa, fica difícil precisar o quanto de DNA há na amostra. A impossibilidade de quantificar o DNA alvo é uma limitação do PCR comum. Outro problema que podemos perceber é o fato da análise ser um processo manual, que requer tempo e muito cuidado.

O advento da técnica da RT-PCR (Real Time Polymerase chain reaction) trouxe um grande avanço na técnica como um todo; a amplificação com detecção simultânea do resultado. Isso acontece porque as amostras emitem florescência na medida em que vão sendo amplificadas e câmeras avaliam em tempo real a emissão de luz e consequentemente, o processo. Mas os principais avanços em relação a PCR convencional foram a quantificação precisa do DNA alvo e a possibilidade de ler os resultados sem abrir os tubos de reação, o que evitaria possíveis contaminações.

A RT-PCR, ou simplesmente qPCR (de quantitative) não necessita de compostos diferentes da PCR convencional, a não ser o fluorocromo responsável pela emissão de luz. Mesmo o material necessário para esse método é bastante semelhante ao método convencional (Centrífugas, pipetadores, ponteiras, etc.), exceto pelo fato de necessitar de um Termociclador especial com câmeras internas adaptadas para realizar a filmagem das amostras bem como hardwares e softwares capazes de ler e interpretar na forma de gráficos a emissão de luz pelos fluorocromos da reação.

O processo da qPCR tem a mesma base da PCR convencional, mas há algumas adições necessárias. Uma das técnicas, conhecida como TaqMan, emprega uma sonda de DNA formada por uma fita simples de nucleotídeos ligada numa extremidade a fluorocromos e na outra a um quencher. Esta fita é, na verdade, uma sonda de DNA e deve ser altamente específicos para a sequencia alvo de DNA que se deseja amplificar. Enquanto o fluorocromo estiver ligado ao quencher, ele passará a sua energia para o quencher via FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), e as câmeras não captarão nada; quando o conjunto liga-se a fita que está sendo amplificada e a polimerase passa por ele, a fita simples de nucleotídeos é degradada e imediatamente o fluorocromo é liberado e começa a emitir luz que é captada pelas câmeras internas do Termociclador. A cada ciclo da PCR, novos fluorocromos vão sendo liberados das sondas e mais luz vai sendo captada pelas câmeras e na medida em que mais amplificações vão ocorrendo na reação, mais fluorocromos são liberados, produzindo cada vez mais brilho. 

Figura 9: fluorocromo sendo liberado e emitindo luz (http://www.lifegene.it/prodotti/diagnostica-umana/infettivologia/li04)

A sensibilidade das câmeras é alta o bastante para detectar a menor variação na intensidade e com isso o programa do computador constrói um gráfico que revela a quantidade exata de material que foi amplificado, ou seja, quanto mais fluorocromos livres emitindo luz, maior a quantidade de cópias produzidas.

Figura 10: Análise em tempo real de forma quantitativa

(http://www.fleury.com.br/Medicos/SaudeEmDia/RevistaMedicinaESaude/pages/diagnostico-precoce-dengue.aspx)

(acima está descrito um método, o Taqman. Não há absolutamente menção ao outro...- PPA)

Essa análise em tempo real traz uma série de vantagens que torna a técnica da PCR em tempo real muito mais eficiente e confiável do que a análise em gel. Pelo fato das análises serem monitoradas em tempo real temos, durante a amplificação, uma confirmação de que a parte específica desejada foi amplificada através da intensidade do brilho do material, além de que amplificações não específicas não influenciam o resultado da reação, isso porque as partes amplificadas que não tiverem o fluorocromo ligado a elas não emitirão luz, ou seja, só a parte amplificada do material desejado será detectado e levado a análise. Justamente por isso, o método em tempo real é muito mais específico, sensível, reproduzível e com ciclos mais rápidos. Os únicos problemas que poderíamos apontar para a qPCR seria a necessidade de um Termociclador especial e por requerer um treinamento específico para a utilização e consequentemente, maior habilidade técnica e suporte, o que de fato, torna a RT-PCR um método promissor para futuros estudos.

Algumas referências

1.  Arnheim, N; Erlich, H; Polymerase Chain Reaction Strategy. ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY, VOL. 61. XIV+1359P. , 1992. p. 131-156.

2.   Appenzeller T. Democratizing the DNA sequence. Science, 1990 Mar 2, 247(4946).

3. Avise, John C.; Molecular markers, natural history and evolution / John C. Avise. – 2nd ed.; p. 100.

4. Kleppe, KE; Khorana, HG; (1971) J. Mol. Biol. 56, 341-346

5. Mullis K. B; Faloona F. A; Scharf S; Saiki R. K; Horn G; Erlich H. A., Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. ColdSpring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1986.

6. Mullis K. B; Faloona F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 1987, 155:335-50.

7. Erlich, H. A; Gelfand, D; Sninsky, J. J. Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction. Science, 1991, v.252, n.5013, 1643-1651.

8. Velikanov, M. V. e Kapral, R. (1999). Polymerase chain reaction: A Markov process approach. J. Theoret. Biol. 201: 239-249.

9. Joe Fore Jr, Ilse R. Wiechers, and Robert Cook-Deegan; The effects of business practices, licensing, and intellectual property on development and dissemination of the polymerase chain reaction: case study. Journal of Biomedical Discovery and Collaboration, 2006, 1:7 doi: 10.1186/1747-5333-1-7.

10. Victor K. McElheny; Drawing the Map of Life, Inside the Human Genome Project. Ed. Basic books, 2010; p. 27.

11. http://www.ufpe.br/biolmol/aula5_clonagem1.htm#5.3 Restrição e Modificação: a ferramenta escondida na bactéria. Acessado em: 31/10/2011