Contribuição: José Pedro Pereira de Lima;Rômulo da Fonsêca dos Santos
(há bastante informação sobre a técnica em si, que seria responsabilidade de outro grupo, mas os exemplos de aplicação estão muito mal elaborados e precisam ser trazidos de forma muito mais completa e mais clara ao leitor; Nenhuma figura tem legenda, o que é uma falha grave. As legendas devem explicar as figuras independente do texto que,por sua vez, não pode depender de uma leitura detalhada das legendas...Em geral, as figuras também não estão sendo chamadas no corpo do texto, o que outro erro grave Fiz uma revisão geral de forma e conteúdo, mas há ainda um bom caminho pela frente– PPA)
1. O Antecessor da Real-Time PCR
O desenvolvimento da técnica da PCR (sigla em inglês para Reação em Cadeia da Polimerase) no início dos anos 80 elevou os estudos no campo da biologia molecular a um novo patamar nunca antes alcançado, sendo considerada um divisor de águas para a ciência. Criou oportunidades jamais imaginadas antes de sua invenção e, nos anos seguintes a sua criação, causou um impacto marcante em diversas áreas, tais como exames médico-laboratoriais, análises ambientais, análises forenses, indústrias alimentícias, dentre outras.
Como muitos sabem, a PCR surgiu de uma ideia de um pesquisador da Cetus Corporation, na Califórnia, chamado Kary Mullis que, posteriormente, no ano de 1993 ganhou o Prêmio Nobel em Química.
Figura 1: Legenda...
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2. Vantagens e Desvantagens da PCR.
O segredo do sucesso da PCR está na capacidade que a técnica tem de amplificar uma sequência específica de DNA aliada à sua relativa simplicidade, especificidade e relevante sensibilidade. Como ponto positivo, não é necessário isolar o DNA alvo da amplificação, ainda que ele se encontre misturado com DNA de outras espécies, visto que a especificidade da PCR é conferida pelos primers. Outros pontos positivos que devem ser considerados são a rapidez da técnica, o baixo custo e a segurança.
Porém, a PCR também apresenta algumas limitações, como a necessidade de conhecer previamente a sequência alvo de DNA para amplificação para que seja possível sintetizar primers específicos. Embora seja uma técnica segura, a contaminação da amostra por DNA previamente amplificado (conhecido como amplicon) ocorre facilmente pelo fato de ser bastante sensível. Possui limitada extensão da sequência que é possível amplificar, sendo difícil aplicar a técnica a sequências maiores que 5kb (5 mil bases). Os resultados das análises em PCR são apenas qualitativos, ou seja, ao terminar de correr o gel só é possível saber se a amostra está íntegra ou não, ou seja, se o material analisado sofreu alguma degeneração durante alguma fase do procedimento ou se foi contaminado, e em muitos casos, quando a qualidade do gel é inferior, resulta em uma baixa resolução. Não é uma análise quantitativa, porém, quando as análises são feitas em géis de poliacrilamida, é possível distinguir os tamanhos dos fragmentos amplificados (bandas) de forma mais precisa, entretanto, nada diz sobre quantidades.
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3. O Surgimento do Real-Time PCR.
Conforme o uso da PCR foi sendo difundido e, consequentemente trazendo avanços não só nos estudos moleculares, como também nas demais áreas onde a técnica era aplicada, se fez necessário o aprimoramento da mesma para que tais limitações fossem superadas afim de obter resultados mais detalhados e robustos para os estudos. Foi assim que surgiu a Real Time PCR (PCR em Tempo Real), técnica que permite análises mais rápidas, que permitem acompanhar a amplificação à medida que ela vai ocorrendo a partir do monitoramento das emissões fluorescentes e ao contrário da PCR convencional, que só é possível saber se houve algo errado com a amplificação ao final da reação, é possível fazer essa verificação à medida que a reação vai acontecendo. Aliado a esses fatores, a PCR em Tempo Real fornece resultados não apenas qualitativos como também, quantitativos: este é, de fato, seu ponto forte e a principal razão de sua adoção.
4. Princípios do Real-Time PCR.
Para auxiliar na compreensão da forma como se dá a PCR em Tempo Real, segue abaixo um esquema ilustrando as principais fases da reaçãosegundo o sistema conhecido como Taqman, desenvolvido pela Applied Biosystems: (A descrição não corresponde às figuras que se seguem: é preciso desconsiderar toda esta parte, que deveria estar detalhadamente descrita na postagem do grupo que descreveu a técnica, mas não está, infelizmente - PPA)
1. Após o preparo, os tubos contendo o material que será submetido a reação são colocados no termociclador e a reação tem início quando a Polimerase encontra o Primer.
2. O laser atinge a sonda fluorescente do primer (ou é sonda, ou é primer...- PPA) (ex. SYBR Green) afim de fazer com que ela emita sua fluorescência.
3. A fluorescência emitida pela sonda fluorescente do primer é absorvida pela molécula inibidora Q (Quencher).
4. O Detector não registra reação por conta da inibição da sonda pelo Quencher.
5. À medida que a reação vai ocorrendo (ciclos), o primer vai sendo estendido (amplificado) pela Polimerase.
6. A amplificação continua conforme os ciclos vão acontecendo até a polimerase encontrar a molécula fluorescente (sonda fluorescente).
7. Ao atingir o primer marcado, a polimerase libera a sonda fluorescente e a molécula inibidora.
8. A reação continua, e a medida que a PCR continua, os primers marcados com sondas vão sendo degradados e as moléculas fluorescentes liberadas vão sendo acumuladas.
9. O detector grava as emissões fluorescentes e toma o acúmulo de fluorescência como medida do progresso de amplificação (quantificação).
O desenvolvimento de sistemas de detecção de fluorescências, capazes de monitorar o acúmulo do produto da PCR à medida que a reação vai ocorrendo trouxe grandes avanços aos métodos de análises moleculares e proporcionou também resultados quantitativos mais confiantes as análises de PCR. Há uma correlação inversa bem estabelecida entre a concentração padrão e a duração da fase latente da reação. O surgimento dessa nova forma de aplicação da PCR trouxe também um grande avanço tecnológico com a criação de uma geração inteira de sistemas que foram desenvolvidos especialmente para explorar essa nova técnica.
5. Real-Time PCR: Como se registra o resultado e se interpretam as curvas resultantes.
Utilizando uma série de reagentes químicos específicos para o processo, o acúmulo dos produtos da reação é monitorado até atingirem um limiar (threshold) ser atingido. Esse tempo de latência (lag time) é então comparado com a curva padrão e a quantificação é feita por meio do cálculo de concentração. (pela leitura não dá para inferir nada, mas isso deveria ter sido explicado por outro grupo. – PPA)
(neste trecho abaixo está explicado, mas de forma pouco clara, como funcional o RT-PCR com SybrGreen, que é diferente do Taqman, erroneamente explicado no texto e nas figuras anteriores. PPA)
Originalmente, a amplificação e detecção simultâneas de uma sequência específica de DNA em tempo real tornou-se possível adicionando-se SYBR Green à reação de PCR convencional, possibilitando que o acúmulo do produto da reação seja visualizado a cada ciclo. Quando o SYBR Green liga-se à dupla fita de DNA e é excitado por luz UV, ele fica fluorescente, sendo assim, a fluorescência aumenta à medida que a amplificação vai acontecendo. Posteriormente, o produto da reação da PCR em tempo real passou a ser quantificado com o monitoramento contínuo da intensidade de emissões fluorescentes do SYBR Green durante a reação de amplificação utilizando-se uma câmera específica, que captura as emissões luminosas transmitindo esses dados a um computador equipado com um programa especialmente desenvolvido para interpretar esses dados e traduzi-los em um gráfico. (Logan e Edwards (2009) – Real-Time PCR: Current Technology and Applications).
6. Real-Time PCR: Aplicações.
Por ser uma técnica bastante apurada e capaz de superar a maioria das limitações existentes na PCR convencional, e por fornecer como resultado para as análises dados apurados e de fácil interpretação, a PCR em Tempo Real tem sido cada vez mais utilizado para análises quantitativas não apenas nos estudos moleculares, como tem sido amplamente empregado em diversas outras áreas Científicas e Tecnológicas, como por exemplo, análises clínicas, indústrias alimentícias, controle de qualidade, análises ambientais, estudo dos Organismos Geneticamente Modificados (OGM’s) dentre várias outras áreas.
Como um exemplo de aplicação desta técnica, podemos citar a utilização desta metodologia para a determinação da carga viral em pacientes contaminados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Devido ao aumento considerável do número de pacientes infectados com esse vírus, houve a necessidade de realizar diagnósticos mais precisos para a determinação da carga viral, assim como a tipagem do vírus para assim determinar o melhor tratamento do paciente com base na quantidade e tipo do agente infeccioso.
Para ser feita a análise de PCR em Tempo Real, é extraída uma amostra de sangue do paciente supostamente infectado com o vírus, e posteriormente amplifica-se esse material que contém ácido nucléico (qual é o ácido nucléico que está em circulação?) a fim de detectar uma sequência alvo de 142pb em uma região altamente conservada do gene gag do HIV. Como esses exames são relativamente caros, primeiramente é feita uma triagem de sangue misturando cerca de 10 a 20 amostras; testando assim todas de uma só vez. Se o exame do conjunto apresentar resultado positivo, cada amostra é então testada individualmente a fim de identificar qual (ou quais) amostras estão realmente infectadas pelo vírus (o que está descrito aqui é detecção: nada tem a ver com carga viral, que é a razão de se da aplicação da RT-PCR). Uma outra versão (???)desse exame é voltada para o uso em conjunção com a apresentação clínica e outros marcadores laboratoriais do progresso da doença para o gerenciamento clínico de pacientes infectados por HIV-1.
No exame propriamente dito (qual, afinal? Carga viral?), o RNA viral é extraído do plasma sanguíneo do paciente e é tratado com a enzima transcriptase reversa para que seja feito o cDNA a partir do RNA do vírus. A PCR é aplicada utilizando dois primers que são sintetizados especificamente para esse tipo de exame, os quais se pensa serem únicos no genoma viral. Ao término do processo de amplificação, os fragmentos amplificados se ligam à parede do recipiente e então são feitos visíveis com uma sonda ligada a uma enzima. A quantidade de vírus na amostra pode ser quantificada de forma tão precisa, que possibilita a detecção de qualquer variação nas unidades de modulação de gene.
(A descrição acima é justamente o que interessa nesta postagem: aplicação de RT-PCR. Mas tudo se resume a um parágrafo!!! – PPA)
7. RT-PCR na detecção de Leishmania
A PCR em tempo real também pode ser de extrema importância para o diagnóstico de uma infinidade de doenças no campo veterinário, como a detecção da Leishmania canina, por ser um método sensível, rápido e ainda pode ser realizada em uma variedade de amostras biológicas, envolvendo sangue periférico, medula óssea e pele. Este método quantitativo permite o acompanhamento contínuo da acumulação de produtos de PCR amplificados. A partir deste acompanhamento, uma estimativa relativa da carga de parasitas em diferentes amostras podem ser obtidas. (De jeito nenhum: a carga parasitária depende de leituras comparativas entre padrões e o material colhido do paciente - PPA)
Para este tipo de diagnóstico é necessário uma mistura mínima contendo o alvo de amplificação do DNA, um par de iniciadores oligonucleotídeos que flanqueiam a sequência alvo, uma DNA polimerase adequada, desoxinucleotídeos, buffer e sais. A monitoração dos produtos amplificados é geralmente baseada na utilização de sondas fluorescentes. A sonda SYBR Green é a mais utilizada para este tipo de detecção por ser não-específica com base em um intercalador dsDNA (cadeia dupla) fluorescente, sendo aplicável a todos os alvos em potencial. A sonda Taqman utiliza uma sonda fluorescente específica para a sequência alvo ladeado pelo primer. Ao longo da polimerização, 5'-3' exonuclease atividade da Taq polimerase digere a sonda e, desta forma o corante repórter (fluorescente) é liberado a partir da sonda e um sinal fluorescente é detectado. A intensidade do sinal é acumulada no final de cada ciclo e está relacionado com a quantidade do produto amplificado, assim podemos obter o resultado indicando a presença da Leishmania na amostra biológica.
(O trecho acima não explica absolutamente nada da aplicação específica)
8. Artigos Relacionados:
Nicolas L, Prina E, Lang T, Milon G. Real-Time PCR for Detection and Quantitation of Leishmania in Mouse Tissues. J Clin Microbiol 40: 1666-1669, 2002.
8. Referências Bibliográficas:
· Real-Time PCR: Current Technology and Applications
· Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization
· PCR Troubleshooting: The Essential Guide
· Methods In Molecular Biology – PCR Protocols
Sites acessados:
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